２０１５年第５Ｏ卷第ｌ０期 生物学通报 ９ 饲养层细胞培养 刘 进 席 超 （北京师范大学生命科学学院 ｊＥ京 １００８７５） 摘要 饲养层细胞在胚胎干细胞培养过程中起重要作用。以原代小鼠成纤维细胞为例，介 绍了饲养层细胞的分离培养和制备过程，并就饲养层细胞如何通过分泌ＬＩＦ（１ｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ，白血病抑制因子）和ＢＭＰ（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，骨形成蛋白家族）等细胞因子，维 持胚胎干细胞的自我复制和未分化状态的分子机制作出概述。 关键词 饲养层细胞 干细胞 细胞培养 中国图书分类号：Ｑ２ 文献标识码：Ａ 胚胎干细胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ＥＳ细胞）是 代ＭＥＦ细胞，本文以ＭＥＦ细胞为例介绍饲养层 细胞的分离培养方法Ｈ， 。 由早期胚胎内细胞团细胞（ｉｎｎｅｒ ｃｅｌｌ ｍａｓｓ，ＩＣＭ） 或原始生殖细胞（ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ，ＰＧＣ）经体 外分离、抑制分化培养获得的多潜能细胞。自 １９８１年英国科学家Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ等［１ 首次成功培 养小鼠胚胎于细胞以来，ＥＳ细胞的研究已经在多 种动物中获得突破性进展。１９９８年，美国威斯康 １．１ 试剂和材料 小鼠胚胎饲养层细胞培养基 （ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｍｅｄｉｕｍ，ＭＥＦＭ）（高糖 ＤＭＥＭ，含ｌ０％胎牛血清）；无Ｃａ２ 、Ｍ 的磷酸盐 缓冲液（ＰＢＳＡ）；０．２５％胰蛋白酶；７０％乙醇；明胶 （高温高压灭菌，０．１％Ｗ／Ｖ）；１０ Ｉ￣ｇ／ｍＬ丝裂霉素 星大学教授Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍａｓｏｎ等成功建立了人胚胎 干细胞系 】。２００６年日本京都大学Ｙａｍａｎａｋａ等把 Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ—Ｍｙｃ和Ｋｌｆ４这４种转录因子基因引 Ｃ溶液（溶于ＤＭＥＭ培养基，过滤除菌）；１００ ｍｍ 组织培养皿；带螺盖的１５ ｍＬ、５０ ｍＬ离心管；离心 机；用于解剖的剪刀、镊子和解剖刀（使用之前高压 灭菌）；０．４％台盼蓝染液；血球计数板；妊娠ｌ３～１４ ｄ 入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化产生多 能干细胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ｉＰＳ ｃｅｌ１）， 的母鼠（常用的小鼠品系包括ＳＶ１２９和Ｃ５７ＢＬ）。 １．２ ＭＥＦ细胞分离和培养（以下所有操作在超 净工作台中进行，并尽量保证无菌操作） １）脱颈法处死孕鼠，用７０％酒精擦洗鼠的腹 面，剪开皮肤和组织暴露子宫，取出子宫角并放到 ｉＰＳ细胞在形态、基因和蛋白表达、细胞倍增能 力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似［３ ３。这些 研究成果为生物医学开辟了一个崭新的领域。然 而，无论是何种来源的干细胞，如何在体外条件下 保持干细胞的自我复制和未分化状态一直都是干 细胞培养过程中的关键因素。目前，采用饲养层细 含有ＰＢＳＡ的１００ ｍｍ培养皿中。 ２）用眼科剪沿子宫纵轴剪开子宫，取出胚胎， 胞培养ＥＳ细胞仍然是维持ＥＳ细胞保持未分化 状态的最有效方法。 去除胎盘、羊膜等胚胎外组织，并用ＰＢＳＡ冲洗去 淤血。 １ 饲养层细胞培养与饲养层制备 ３）用镊子去除胚胎头、四肢和内脏，ＰＢＳＡ清 常用于制备饲养层细胞的来源主要有：原代小 鼠成纤维细胞（ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ，ＭＥＦ）、 小鼠成纤维细胞系（ＳＴＯ）和同源动物胎儿成纤维 洗２－３次去除血和残余的内脏组织。 ４）将胚胎剩余部分转移至干净的１００ ｍｍ培 养皿中，去掉多余的ＰＢＳＡ，用眼科剪将胚胎剪成 １ ｍｍ。大小的小块。 细胞。这些细胞经丝裂霉素Ｃ或 射线照射处理 后抑制其有丝活性，然后接种至明胶包被的 培养皿中作为ＥＳ细胞培养的饲养层细胞。目前 最广泛用于支持ＥＳ细胞培养的饲养层细胞是原 ５）将剪碎的胚胎转移至无菌的１５ ｍＬ离心管， 加入１０ ｍＬ胰蛋白酶，在３７℃水浴中孵育１０— ２０ ｍｉｎ。 １０ 生物学通报 ２０１５年第５Ｏ卷第ｌＯ期 ６）待小块沉淀后，从孵育管中取出５ ｍＬ胰蛋 白酶液和分散的细胞，并且转移至无菌的５０ ｍＬ离 心管中。 ７）在５０ ｍＬ离心管中加入等体积的ＭＥＦＭ以 抑制胰蛋白酶活性。 ８）加入５ ｍＬ ０．２５％胰蛋白酶至原先含有胚 胎的１５ ｍＬ离心管中，并在３７℃水浴中孵育ｌ０— ２０ ｍｉｎ。 ９）重复步骤６－８，大约进行５次孵育，将所有 加入的胰蛋白酶和分散的细胞放人同一个５０ ｍＬ 离心管中。 １０）用力分散细胞悬液并允许剩余的小块沉淀。 １１）取出细胞悬液，去除沉淀。 １２）１ ０００ ｇ，离心５ ｍｉｎ，收集细胞沉淀。 １３）用１０ ｍＬ ＭＥＦＭ重悬沉淀，并用台盼蓝染 色后计数活细胞数量。 １４）每１×１０ 个细胞重悬于１０ ｍＬ ＭＥＦＭ，并 接种至１个１００ ｍｍ培养皿中。 １５）培养皿放置在３７℃、５％Ｃ０ 培养箱中孵 育过夜。 １６）第２天，用１０ ｍＬ新鲜的ＭＥＦＭ置换旧 的培养基以去除细胞碎片。 １７）当细胞汇合率达到８０％－９０％时即可冻存 备用。 注意事项：利用上述方法分离的ＭＥＦ细胞并 不纯，其主要成分是成纤维样细胞，但还有神经样 细胞、心肌细胞和其他一些类型不清楚的细胞。由 于成纤维样细胞增殖速度快，随着传代次数的增 加，杂细胞数量逐渐减少，细胞成分也趋于单一， 但是细胞的增殖能力也会随之下降，一般３－５代 后细胞基本停止增殖，所以实验中所用的饲养层 细胞传３代以内为佳。 １．３ ＭＥＦ细胞的传代、冻存和复苏 １）传代。取汇合度约为８０％的ＭＥＦ细胞培养 皿，弃掉旧培养基，用１０ ｍＬ ＰＢＳＡ洗１次细胞； 加入３ ｍＬ胰蛋白酶液并在３７℃孵育３－５ ｍｉｎ（具 体时间视胰酶消化程度而定）；加入１０ ｍＬ ＭＥＦＭ 终止胰酶消化作用，并通过反复吹吸打散所有细 胞，确保没有粘连，以防止成团；将细胞悬液转入 １５ ｍＬ无菌离心管中，１ ０００ ｒｐｍ离心５ ｍｉｎ；将 ５ ｍＬ ０．１％明胶加入３个１００ ｍｍ空培养皿中室 温孵育至少５ ｍｉｎ；离心后弃去上清液，敲击管壁 使细胞沉淀分散，并加入３ ｍＬ ＭＥＦＭ重悬；弃去 之前准备好的３个培养皿中的明胶，并分别加入 １２ ｍＬ ＭＥＦＭ；将３ ｍＬ ＭＥＦ细胞悬液平均分配到 ３个培养皿中；将培养皿放入３７℃、５％ＣＯ２培养 箱中孵育。当培养皿中细胞汇合度达到８０％左右 时仍按照上述方法进行传代培养。 ２）冻存和复苏。由于ＥＳ细胞培养过程中需要 大量、高质量、不同代（ｐ０－ｐ４）的ＭＥＦ细胞，这就 要求实验之前储备足够的ＭＥＦ细胞。一方面传代 次数早的细胞（ｐ０－ｐ２）可以通过继续传代培养提 供大量的更高代次（ｐ３－ｐ４）细胞以维持ＥＳ细胞 日常生长；另一方面也可通过冻存的方法将ＭＥＦ 细胞冻存起来作为储备细胞，需要的时候再复苏 以供实验需要。ＭＥＦ细胞冻存和复苏的方法与普 通细胞类似，只是培养皿中需要预先加入０．１％明 胶孵育，具体操作方法可以参考其他相关资料［６ ３。 １．４饲养层制备 １）丝裂霉素Ｃ处理法。从培养箱中取出长至 ８ｏ％￣Ｅ合度的ｐ３或ｐ４代的ＭＥＦ细胞培养皿，弃 去旧培养基，加入６ ｍＬ丝裂霉素Ｃ溶液，３７℃ 孵育２ ｈ；孵育之后，用５ ｍＬ ＰＢＳＡ洗细胞２次， 以去除多余的丝裂霉素Ｃ；加入６ ｍＬ胰酶，室温 下孵育３－５ ｍｉｎ，加入等体积含有血清的ＭＥＦＭ 以终止胰酶消化作用，并转入１５ ｍＬ离心管中； １ ０００ ｒｐｍ，离心５ ｍｉｎ；弃上清液，用５ ｍＬ ＭＥＦＭ 重悬细胞沉淀，利用血球计数板计数；按１０５个／ｃｍ 细胞密度接种至０．１％明胶包被的培养皿中。饲养 层细胞的接种密度以５０％～６０％汇合度为宜。 ２） 射线照射法。如果实验室具备钴源设备， 且使用便利，可以考虑使用 射线照射法制备饲养 层细胞，因为 射线照射的方法简单且效率高。将 培养皿中的细胞送至钴源室，照射剂量２５－３５ Ｇｙ， 可以使细胞失去有丝活性，但细胞仍可以存 活一段时间。经过照射处理后的细胞按照丝裂霉 素Ｃ处理后的相同操作步骤制备饲养层细胞。具 体的照射剂量需要根据实际情况摸索之后而定， 避免因剂量过大造成细胞大量死亡。 ２饲养层细胞维持ＥＳ细胞自我复制和未分化 状态的分子机制
