・９４・ Ｉｎｆｅｃｔ ｌｎｆｌａｒｎｒｎ Ｒｅｐ，Ｖｏ１．９ Ｎｏ．２ Ｊｕｎ．２００８ ・论 著・ ｐＥＴ１４ｂ—Ｈｉｓ－ＴＡＴ－ＥＲＫ２和无活性突变体 ｐＥＴ１４ｂ－Ｈｉｓ－ＴＡＴ－ＥＲＫ２（ＡＦ） 原核表达载体的构建和表达 杨丽萍姚咏明 （解放军总医院第一附属医院烧伤研究所，北京 １０００３７） 【摘要】 目的：构建基于转录激活因子（ＴＡＴ）技术的细胞外信号调节激酶（ＥＲＫ）２及其无活性突变体 ＥＲＫ２（ＡＦ）原核载体并在大肠杆菌ＢＩ ２１（ＤＥ３）中表达。方法：采用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术从ｐｃＤＮＡ３一Ｆｌａｇ－ ＥＲＫ２和ｐｃＤＮＡ３－Ｆｌａｇ—ＥＲＫ２（ＡＦ）质粒中扩增出ＥＲＫ２和ＥＲＫ２（ＡＦ）基因，插入ｐＥＴ１４ｂ—Ｈｉｓ—ＴＡＴ载体中，构 建重组质粒ｐＥＴ１４ｂ－Ｈｉｓ—ＴＡＴ—ＥＲＫ２和ｐＥＴ１４ｂ—Ｈｉｓ—ＴＡＴ－ＥＲＫ２（ＡＦ），并诱导原核表达、纯化融合蛋白。采用 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ方法检测表达蛋白的Ｈｉｓ标签。结果：酶切和测序结果表明，扩增的ＥＲＫ２和ＥＲＫ２（ＡＦ）基因正 确，大小为１ ０８２ ｂｐ；１０ ＳＤＳ—ＰＡＧＥ凝胶电泳可见原核表达纯化得到高纯度目的蛋白，大小为４１ ｋＤ；Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测显示，原核蛋白带有Ｈｉｓ标签。结论：成功构建了ＥＲＫ２和ＥＲＫ２（ＡＦ）的原核表达载体，该载体能在大 肠杆菌中表达，纯化得到了Ｈｉｓ－ＴＡＴ－ＥＲＫ２和Ｈｉｓ—ＴＡＴ—ＥＲＫ２（ＡＦ）蛋白，为研究ＥＲＫ２蛋白的功能提供了重要 工具。 关键词 转录激活因子细胞外信号调节激酶２蛋白转导 载体构建 Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐＥＴ１４ｂ－Ｈｉｓ－ＴＡＴ－ＥＲＫ２ ａｎｄ ｐＥＴ１４ｂ－Ｈｉｓ－ＴＡＴ－ＥＲＫ２（ＡＦ）一ｉｎｃｏｍｐｅｎｔｅｎｃｅ ｍｕｔａｎｔ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ Ｙａｎｇ Ｉ ｉｐｉｎｇ，Ｙａｏ Ｙｏｎｇｍｉｎｇ．Ｂｕｒｎｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｆｉｒｓｔ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ ＰＩ Ａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉ— ｔａｌ。Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００３７，Ｃｈｉｎａ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：Ｙａｏ Ｙｏｎｇｍｉｎｇ（Ｅｍａｉｌ：Ｃ ｆｆ＠ｓｉｎａ．ｃｏｒｎ） Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ： Ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｐＥＴ１４ｂ—Ｈｉｓ—ＴＡＴ—ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ＿ｓｉｇｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＲＫ）２ ａｎｄ ｐＥＴ１４ｂ－Ｈｉｓ—ＴＡＴ—ＥＲＫ２（ＡＦ）一ｉｎｃｏｍｐｅｎｔｅｎｃｅ ｍｕｔａｎｔ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓ—ａｃｔｉｎｇ ａｃ— ｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＴＡＴ）ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｌｉ ＢＩ ２１（ＤＥ３）．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ ＥＲＫ２ ａｎｄ ＥＲＫ（ＡＦ）ｇｅｎｅ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｐｃＤＮＡ３一Ｆｌａｇ—ＥＲＫ２ ａｎｄ ｐｃＤＮＡ３一Ｆｌａｇ—ＥＲＫ２（Ａ．Ｆ）ｐｌａｓｍｉｄｓ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）ａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＥＴ１４ｂ—Ｈｉｓ—ＴＡＴ ｖｅｃｔｏｒ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｗｅｒｅ ｖｅｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｔｈｅ ＥＲＫ２ ａｎｄ ＥＲＫ２（ＡＦ）ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｅｒｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ＢＩ ２ １（ＤＥ３）。 ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅｉｒ Ｈｉｓ ｔａｇ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｌｏｎｅｄ ＥＲＫ２ ａｎｄ ＥＲＫ２（ＡＦ）ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ｃｏｒｒｅｃｔ ｔｏ ｂｅ １０８２ ｂＤ．ＨＴ—ＥＲＫ２ ａｎｄ ＨＴ—ＥＲＫ２（ＡＦ） ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｅｒｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ＢＩ ２１（ＤＥ３），ｂｅｉｎｇ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ ４１ ｋＤ．Ｈｉｓ ｔａｇ ｉｎ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗａｓ ｖｅｒｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔ— ｅｒｎ ｂｌｏｔ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ｐＨｉｓ—ＴＡＴ－ＥＲＫ２ ａｎｄ ｐＨｉｓ—ＴＡＴ—ＥＲＫ２（ＡＦ）一ｉｎｃｏｍｐｅｎｔｅｎｃｅ ｍｕｔａｎｔ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｒｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ．ＨＴ—ＥＲＫ２ ａｎｄ ＨＴ—ＥＲＫ２（ＡＦ）ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ，ａｎｄ ｔｈｅｙ ｍｉｇｈｔ ｓｅｒｖｅ ａｓ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｔｏｏｌｓ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＥＲＫ２． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｔｒａｎｓ—ａｃｔｉｎｇ ａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ＿ｓｉｇｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ２ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ ｃ０ｎｓｔｒｕｃｔｉ０ｎ 细胞外信号调节激酶（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ—ｓｉｇｎａｌ ｒｅｇ－ ｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＥＲＫ）属于丝裂原活化蛋白激酶 为应用。该方法简单可行，不影响生物大分子的活 性，可高效地介导目的蛋白穿透生物膜进入细胞。 （ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ，ＭＡＰＫ）超家 族，参与调节细胞的增殖、分化以及多种代谢功能， 通过抑制细胞凋亡而促进细胞生存Ｅ 。近年来， 一本研究应用ＴＡＴ蛋白技术，构建了ＥＲＫ２及其无 活性突变体ＥＲＫ２（ＡＦ）的原核表达载体，为深入探 基金项目；国家重点基础研究发展规划项目（２００５ＣＢ５２２６０２）；国家 自然科学基金资助项目（３０６７２１７８） 通讯作者；姚咏明（Ｅｒｎａｉｌ：ｃ＿ｉｆ＠ｓｉｎａ．ｃｏｒｎ） 种新的技术——转录激活因子（ＴＡＴ）融合蛋白 转导技术作为研究蛋白质功能的一种重要手段被广 维普资讯 http://www.cqvip.com
感染、炎症、修复２００８年６月第９卷第２期 讨ＥＲＫ蛋白质的功能提供了可能。 １材料与方法 １．１ 主要试剂 限制性内切酶、ＤＮＡ连接酶、Ｔａｑ 酶和１ ｋｂＤＮＡ标准物购自ＴａＫａＲａ公司；ＤＮＡ纯 化试剂盒和凝胶回收试剂盒购自申能博彩公司； ＤＭＥＭ培养基、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００转染试剂购 自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；抗Ｈｉｓ抗体购自Ｓｉｇｍａ公司； Ｉ Ｂ培养基和异丙基一Ｉ）Ｉ硫代半乳糖苷购自Ｇｉｂｃｏ公 司；Ｎｉ ～ＮＴＡ亲和树脂购自Ｑｉａｇｅｎ公司。 １．２ 质粒、菌种和细胞表达载体ｐＥＴ１４ｂ—Ｈｉｓ— ＴＡＴ载体由南方医科大学姜勇教授馈赠；大肠杆菌 ＤＨ５ａ和ＢＬ２１（ＤＥ３）由本实验室保存。野生型及 双磷酸化位点突变的ｆｌａｇ标记质粒ｐｃＤＮＡ３一Ｆｌａｇ— ＥＲＫ２、ｐｃＤＮＡ３一Ｆｌａｇ—ＥＲＫ２（ＡＦ）由北京大学顾军 教授馈赠。ＳＶ４０病毒转化的人胚胎肾细胞２９３Ｔ 由本实验室保存（采用含１０ 热灭活小牛血清的 ＤＭＥＭ培养基，于５ Ｃｏ：孵箱内３７℃常规培 养）。 １．３ ｐＥＴ１４ｂ－Ｈｉｓ一１ ｒ—ＥＲＫ２和ｐＥＴ１４ｂ－Ｈｉ－ｓ１ ｒ— ＥＲＫ２（ＡＦ）重组质粒的构建 １．３．１ 人ＥＲＫ２和ＥＲＫ２（ＡＦ）的聚合酶链式反应 （ＰＣＲ）扩增根据ＧｅｎＢａｎｋ中报告的序列设计引物。 用于ＰＣＲ扩增的上游引物为：５ ～ＧＧＡ ＧＣＧ ３ ；下游引物 为：５ ＣＣＧＣＴＣＧＡＣ 、Ａ ＡＧｐ ＣＴＧＴ［ ℃ＣＴＧＧＣＴＧ— ＧＡ ３ 。上、下游引物５ 端分别携带ＮｄｅＴ和ＸｈｏＩ酶切 位点。ＰＣＲ引物由北京赛百盛基因技术有限公司合 成。ＰＣＲ模板为ｐｃＤＮＡ３一Ｆｌａｇ－ＥＲＫ２、ｐｃＤＮＡ３一Ｆｌａｇ ＥＲＫ２（ＡＦ）。ＰＣＲ反应条件：首先９４℃变性１ ｍｉｎ，然 后以５６℃复性１．５ ｍｉｎ、７２℃延伸５ ｍｉｎ，进行３０个 循环。 １．３．２原核表达载体的构建、酶切鉴定与测序 上述 ＰＣＲ产物琼脂糖凝胶电泳，将目的片段ＥＲＫ２和 ＥＲＫ２（ＡＦ）切胶回收，回收产物和ｐＥＴ１４ｂ－Ｈｉｓ－ＴＡＴ 载体用内切酶ＮｄｅＩ和ｘｈｏＩ消化，二者通过Ｔ４连接酶 １６℃条件下连接１６ ｈ。连接产物１０ １转化感受态菌 ＤＨ５ａ，铺琼脂糖ＬＢ平板，３７℃孵箱倒置培养１２～ １６ ｈ。待平板长出菌落后，挑取单菌落于５ ｍｌ加氨苄 青霉素（Ａｍｐ）的ＬＢ培养基中，置３７℃摇床培养１２ ｈ， 小量制备质粒，转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，提取转化质粒，利 用酶切和测序鉴定重组质粒。 １．４ Ｈｉｓ—ＴＡＴ—ＥＲＫ２和Ｈｉｓ—ＴＡＴ—ＥＲＫ２（ＡＦ）融 合蛋白的原核表达与纯化 将鉴定正确的重组质粒 ・ ９５ ・ 转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３），挑取转化后单菌落置于 ２ ｍｌ含Ａｍｐ的Ｉ Ｂ培养液中，室温振摇培养至６００ ｎｍ处吸光度值约为０．６时加入终浓度为１ ｍｍｏｌ／ Ｉ 的ＩＰＴＧ诱导，继续振摇３ ｈ。诱导结束后取诱导 前和诱导后菌液０．５ ｍｌ，经１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定融 合蛋白表达的情况。对有融合蛋白表达的菌落进行 大量（５００ ｍ１）扩增诱导，用Ｎｉ抖离子亲和树脂层析 纯化得到蛋白，最后用１０ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳鉴定 蛋白的纯度。 １．５ Ｈｉｓ—ＴＡＴ—ＥＲＫ２和Ｈｉｓ ＴＡＴ—ＥＲＫ２（ＡＦ）蛋 白的Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测 将纯化得到的ＥＲＫ２及 其突变体蛋白质稀释１０倍后进行１０ ＳＤＳ—ＰＡＧＥ 电泳，然后用特异性的抗Ｈｉｓ抗体行Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 检测。 ２ 结 果 ２．１ ｐＥＴ１４ｂ＿Ｈｉｓ＿１Ⅺ一ＥＲＫ２和ｐＥＴ１４ｂ＿Ｈｉｓ＿１ ｒ— ＥＲＫ２（ＡＦ）重组质粒的构建 ２．１．１ 人ＥＲＫ２和ＥＲＫ２（ＡＦ）片段的ＰＣＲ扩增 从ｐｃＤＮＡ３～Ｆｌａｇ—ＥＲＫ２、ｐｃＤＮＡ３一Ｆｌａｇ—ＥＲＫ２（ＡＦ） 中扩增的人ＥＲＫ２和ＥＲＫ２（ＡＦ）片段为１ ０８２ ｂｐ， 结果见图１。 ２ ０００ｂｐ １ ０００ｂｐ ７５０ｂｐ ５００ｂｐ ２５０ｂｐ １００ｂｐ 图１人ＥＲＫ２和ＥＲＫ２（ＡＦ）的ＰＣＲ产物 注：Ｍ：ＤＮＡ标准；１：ＥＲＫ２；２：ＥＲＫ２（ＡＦ） ２．１．２ ｐＥＴ１４ｂ—Ｈｉｓ—ＴＡＴ—ＥＲＫ２和ｐＥＴ１４ｂ—Ｈｉｓ— ＴＡＴ—ＥＲＫ２（ＡＦ）重组质粒酶切测序鉴定 用Ｎｄｅ Ｉ和Ｘｈｏ Ｉ双酶切重组质粒ｐＥＴ１４ｂ—Ｈｉｓ—ＴＡＴ— ＥＲＫ２和ｐＥＴ１４ｂ—Ｈｉｓ—ＴＡＴ—ＥＲＫ２（ＡＦ），然后１ 琼脂糖电泳，均切出大小为１ ０８２ ｂｐ的片段（图２）。 ＤＮＡ序列分析结果证实，该插入片段为人ＥＲＫ２ 和ＥＲＫ２（ＡＦ）基因。 维普资讯 http://www.cqvip.com
・ ９６ ・ ２ Ｍ １０ ０００ｂｐ ６ ０００ｂｐ ４０００ｂｐ ３ ０００ ｂｐ 图２重组质粒ｐＥＴ１４ｂ－Ｈｉｓ－ＴＡＴ－ＥＲＫ２和 ｐＥＴ１４ｂ－Ｈｉｓ－ＴＡＴ－ＥＲＫ２（ＡＦ）酶切鉴定图 注：Ｍ：１ ｋｂ ＤＮＡ标准；１：用Ｎｄｅ Ｉ ａｎｄ Ｘｈｏ Ｉ 内切酶消化的ｐＥＴ１４ｂ Ｈｉ．ＴＡＴ—ＥＲＫ２； ２：用ＮｄｅＩ ａｎｄ ＸｈｏＩ内切酶消化的 ｐＥＴ１４ｂ—Ｈｉｓ—ＴＡＴ—ＥＲＫ２（ＡＦ） ２．２ 融合蛋白的原核表达与纯化ｐＥＴ１４ｂ Ｈｉｓ— ＴＡＴ—ＥＲＫ２和ｐＥＴ１４ｂ—Ｈｉｓ—ＴＡＴ—ＥＲＫ２（ＡＦ）质 粒转化大肠杆菌ＢＩ ２１（ＤＥ３），挑取单个菌落培 养，经ＩＰＴＧ诱导后采用Ｎ —ＮＴＡ磁珠亲和层析 纯化，ｌ０ ９／６ＳＤＳ—ＰＡＧＥ凝胶电泳可见在４１ ｋＤ左右 有一特异性蛋白条带（图３）。 ４ ９７．４ ｋＤ ６６．２ ｋＤ ４３．０ ｋＤ 图３ Ｈｉｓ＿ＴＡＴ＿ＥＲＫ２和Ｈｉｓ－ＴＡＴ－ＥＲＫ２（ＡＦ） 蛋白表达纯化 注：Ｍ：蛋白质标准；１：Ｈｉｓ—ＴＡＴ－ＥＲＫ２蛋白的 第一次洗脱；２：Ｈｉｓ—ＴＡＴ－ＥＲＫ２蛋白的第二次洗脱； ３：Ｈｉｓ－ＴＡＴ—ＥＲＫ２（ＡＦ）蛋白的第一次洗脱； ４：Ｈｉｓ—ＴＡＴ－ＥＲＫ２（ＡＦ）蛋白的第二次洗脱 ２．３原核蛋白Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测 纯化得到的蛋 白用特异的抗Ｈｉｓ抗体进行Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测可 见，在预想大小的位置见到大小为４１ ｋＤ的蛋白（图 ４）。 ２ Ｍ ９８ ｋＤ ５ｌ ｋＤ ３７ ｋＩ） ２９ ｋＤ 图４ Ｈｉｓ－ＴＡＴ—ＥＲＫ２和Ｈｉｓ－ＴＡＴ－ＥＲＫ２（ＡＦ） 蛋白的Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测 注：Ｍ：蛋白质Ｍａｒｋｅｒ；１：Ｈｉｓ ＴＡＴ—ＥＲＫ２蛋白； ２：Ｈｉｓ ＴＡＴ—ＥＲＫ２（ＡＦ）蛋白 ３讨 论 目前有很多技术可将生物大分子转导进入真核 细胞，其中核酸转导方法被广泛使用。然而无论是 病毒法还是非病毒法，均存在一定的缺点。前者采 用基因组中带有目的片段的病毒来感染靶细胞，步 骤繁琐，费用高，周期较长，而且由于所使用的病毒 不同，还会产生生物安全性问题；后者在ＤＮＡ的转 导效率、可重复性及使用方便性方面都存在差异，且 有效的ＤＮＡ转导会伴随某些毒性或细胞的抑制， 其程度与使用试剂、步骤和目的细胞密切相关。质 膜对于物质的选择通透作用使得生物大分子难以传 输进入细胞，该问题促使人们要构建一种理想的能 够高效运载大分子进入细胞的系统。本研究中使用 的人类免疫缺陷病毒（ＨＩＶ）ｌ型的反式激活因子 ＴＡＴ是一种正调控蛋白质，可以使所携带的核酸高 效进入真核细胞。１９９８年ＴＡＴ介导的蛋白转导首 先被报道，有人将ＴＡＴ蛋白质中包含ＰＴＤ区段的 不同肽段和其他外源蛋白导入体外培养的细胞及小 鼠部分组织，从此ＴＡＴ介导的蛋白转导技术被广 泛应用于生物医学研究和临床药物治疗领域。据报 道，ＴＡＴ蛋白内介导蛋白传递的核心序列由１１个 氨基酸组成，其序列为ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ［３］。将这 一核心序列与多肽、蛋白质及ＤＮＡ共价连接后，它 们可不依赖于受体和转运物质进入几乎所有的组织 和细胞，甚至能够通过血脑屏障，转导效率高且对细 胞没有损伤 ］。本研究中，我们利用上述方法将目 的基因ＥＲＫ２和ＥＲＫ２（ＡＦ）克隆进入包含有ＴＡＴ 的原核表达载体，在大肠杆菌中诱导表达并纯化 维普资讯 http://www.cqvip.com 感染、炎症、修复２００８年６』ｊ第９卷第２期 ・ ９７ ・ ＥＲＫ２和ＥＲＫ２（ＡＦ）蛋白。在将蛋白简单处理后 即可直接加入细胞培养基中，对我们的目的蛋白进 行功能研究。最近的一项研究将抗ｍｌｇＧ抗体细胞 ２ Ｊｅｏｎ ＳＨ，Ｉ．ｅｅ ＭＹ，Ｋｉｍ ＳＪ，ｅｔ ａ１．Ｔａｕｒｉｎｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉ｛ ｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ａｎ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ［Ｍｇ‘ ］ｉ ａｃｃｏｍｐａｎｉｅｄ ｂｙ ＥＲＫ １／２ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌｓ．ＦＥＢＳ Ｉ ｅｔｔ， ２００７，５８１（３０）：５９２９ ５９３４ 分别用 。ＩＴＡＴ肽段标记和“ ＩｎＴＡＴ肽段标记，结 果表明前者能够更快地促进抗ｍＩｇＧ抗体细胞的渗 透和核吸收 。此方法固然新颖可行，然而其安全 ３ Ｋｏｙａｎａｇｉ Ｔ，Ｎｏｇｕｃｈｉ Ｋ，Ｏｏｔａｎｉ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｈｉ ｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｅｐｓｉｌｏｎ ＰＫＣ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｃｈｒｏｎｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ 性却不如我们使用的ＴＡＴ方法。 ＥＲＫ２是一类丝／苏氨酸蛋白激酶，生理状态下 ｃａｒｄｉａｃ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｍｏｄｅ１．Ｊ Ｍｏｌ（；ｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ，２００７，４３（４）： ４０４ ４０８ 位于胞浆，在生长因子、内毒素、革兰阳性菌等刺激 后激活转位入核，调节转录因子活性，产生生理效 应。目前对ＥＲＫ２研究较多的方面是其参与调节 细胞增殖、分化和存活等 。有研究证实，在表皮 生长因子刺激下，ｐ３８ ａｌｐｈａ异构体Ｍｘｉ２与ＥＲＫ２ ４ Ｓｅｇｕｒａ Ｔ，Ｈｕｂｂｅｌｌ ＪＡ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ＡＢＣ ｔｒｉｂｌｏｃｋ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ，２００７，１８（３） ７３６ ７４５ ５ Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ Ｂ，Ｈｕ Ｍ，ＭｃＩ ａｒｔｙ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｉｍｐｏｒｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ“ Ｉｎ ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｄ 。。Ｉ ｌａ 结合后通过维持后者的磷酸化水平影响它在核内的 功能，从而干扰ＥＲＫ２介导的多种生理过程［８］。 Ｄｕｍｉｔｒｕ等 研究发现，内毒素介导的肿瘤坏死因 子一ａ（ＴＮＦ—ａ）产生在转录后水平依赖Ｔｐｌ２／ＥＲＫ途 ｂｅｌｅｄ Ｈ ＩＶ——１ ｔａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊ ｕｇａｔｅｓ ｉｎ ＢＴ ４７４ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ，２００７，３４（１）：３７ ４６ ６ Ｋｕｎａｔｈ Ｔ，Ｓａｂａ Ｅｌ Ｉ ｅｉｌ ＭＫ，Ａｌｍｏｕｓａｉｌｌｅａｋｈ Ｍ，ｅｔ ａ１．ＦＧＦ 径。我们采用大鼠烫伤后金黄色葡萄球菌攻击致脓 毒症模型，通过抑制ＥＲＫ磷酸化水平显著下调 ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｒｋｌ／２ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｃａｓｃａｄｅ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐ［ｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｓｅｌｆ ｒｅｎｅｗａｌ ｔｏ ｌｉｎｅａｇｅ ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００７，Ｉ３４（１６）：２８９５—２９０２ ＴＮＦ—ａ基因及蛋白表达，并减轻肝、肺、肾等器官功 能损害ｌ】 。以上资料说明，ＥＲＫ２在介导炎症反应 和细胞因子生成中发挥着重要作用，然而ＥＲＫ２调 ７ Ｍｅｌｏｃｈｅ Ｓ，Ｐｏｕｙｓｓｅｇｕｒ Ｊ．Ｔｈｅ ＥＲＫ１／２ ｍｉｔｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏ— ｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｐａｔｈｗａｙ ａｓ ａ ｍａｓｔｅｒ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｇ１—・ｔｏ Ｓ—ｕｐｈａｓｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００７，２６（２２）；３２２７－３２３９ 节炎症的具体作用机制仍未完全阐明。本研究利用 ＴＡＴ介导的蛋白转导技术将ＥＲＫ２及其突变体构 建进入ｐＥＴ１４ｂ—Ｈｉｓ—ＴＡＴ载体，经过诱导后在大肠 杆菌中表达，纯化得到融合蛋白ＥＲＫ２及其无活性 ８ Ｓａｎｚ—Ｍｏｒｅｎｏ Ｖ，Ｃａｓａｒ Ｂ，Ｃｒｅｓｐｏ Ｐ．ｐ３８ａｌｐｈａ ｉｓｏｆｏｒｍ Ｍｘｉ２ ｂｉｎｄｓ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ——ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ １ ａｎｄ ２ ｍｉｔｏｇｅｎ——ａｃ—— ｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｉｔｓ ｎｕｃｌｅａｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ＳＵＳ ｔａｉｎｉｎｇ ｉｔｓ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ． Ｍｏｌ（；ｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２００３，２３（９）： ３０７９－３０９０ 突变体，为后续工作奠定了基础。其作用，一方面， 将其直接导入各种与炎症相关的目的细胞，建立细 胞模型，可以检测多种下游基因以及细胞因子在基 因和蛋白水平的表达，并且筛选不同的作用片段；另 一方面，可以在导入它们后加入实验阶段的新药，检 ９ Ｄｕｍｉｔｒｕ ＣＤ，Ｃｅｃｉ ＪＤ，Ｔｓａｔｓａｎｉｓ Ｃ，ｅｔ ａ１．ＴＮＦ—ａｌｐｈａ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ 测其抗炎效果，为评价其有效性提供实验依据。总 之，本实验成功构建了ＥＲＫ２和ＥＲＫ２（ＡＦ）的原核 表达载体，为深入研究ＥＲＫ２蛋白的功能提供了重 要工具。 参 考 文 献 １ Ｏｌｌｉｎｇｅｒ Ｒ，Ｋｏｇｌｅｒ ｔ’，Ｔｒｏｐｐｍａｉｒ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｂｙ Ｉ．ＰＳ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ ｖｉａ ａ ＴｐＩ２／ＥＲＫ ｄｅ ｐｅｎｄｅｎｔ ｐａｔｈｗａｙ．Ｃｅｌｌ，２０００，１０３（７）：１０７１—１０８３ １Ｏ姚咏明，程明华，姚胜，等．细胞外信号调节激酶抑制剂对烫伤 脓毒症大鼠肿瘤坏死因子ａ表达的影响及意义．中华外科杂 志，２００４，４２（７）：３９１ ３９５ （收稿日期：２００８—０１—０４） ｇｒｏｗｔｈ ｖｉａ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＥＲＫ．Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ，２００７，６（２４）［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ￣ 告读者：凡所投稿件为国家或省、部级基金资助项目，或者属攻关项目，或者为立项课题者，我刊收稿后将优先刊用。请投稿者投稿 时留下电子邮箱地址及联系电话。如１５日内未收到答复，可来电询问。投稿时请将相关基金批件复印件一并寄至编辑部。
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