同时测定再造烟叶中草酸、琥珀酸、硫酸和磷酸根的离子色谱方法及

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 105372371 A (43)申请公布日 2016.03.02

(21)申请号 201510870988.1(22)申请日 2015.12.01

(71)申请人广东中烟工业有限责任公司

地址510385 广东省广州市荔湾区东沙环翠

南路88号(72)发明人施文庄 胡静 李峰

(74)专利代理机构广州粤高专利商标代理有限

公司 44102

代理人任重(51)Int.Cl.

G01N 30/88(2006.01)G01N 30/06(2006.01)

权利要求书1页 说明书7页 附图3页

(54)发明名称

同时测定再造烟叶中草酸、琥珀酸、硫酸和磷酸根的离子色谱方法及应用(57)摘要

本发明公开了一种同时测定再造烟叶中草酸、琥珀酸、硫酸和磷酸根的离子色谱方法。本发明建立了以甲基磺酸为提取液保障样品中各个待测组分的提取效率达到99.7%以上，同时以碳酸钠和碳酸氢钠混合溶液为流动相，有效消除维生素C降解对草酸定量的影响，一次样品处理和进样可以同时检测再造烟叶中草酸、琥珀酸、硫酸和磷酸四种组分，各个待测组分测试含量的相对标准偏差为0.27%～0.99%，加标回收率在99.3%～106.2%之间，准确、简单、可靠，同时适用于烟草样品和再造烟叶样品中相关组分的测定。 C N 1 0 5 3 7 2 3 7 1 A CN 105372371 A

权 利 要 求 书

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1.一种同时测定再造烟叶中草酸、琥珀酸、硫酸和磷酸根的离子色谱方法，其特征在于，是将再造烟叶样品以甲基磺酸作为萃取液振荡萃取后滤液经滤膜过滤，然后进行离子色谱分析；

所述色谱分析条件，分析柱：AS22-4 mm ；柱温：30℃；淋洗液：4.5 mmol/L NaCO3+1.4 mmol/L NaHCO3；流速：1.2 mL/min；进样量：50 µL；抑制器电流：31 mA；检测器：自循环阴离子抑制电导检测。

2.根据权利要求1所述同时测定再造烟叶中草酸、琥珀酸、硫酸和磷酸根的离子色谱方法，其特征在于，在所述离子色谱分析前还包括将滤液采用固相萃取柱进行净化处理步骤。

3.根据权利要求2所述同时测定再造烟叶中草酸、琥珀酸、硫酸和磷酸根的离子色谱方法，其特征在于，所述固相萃取柱净化处理是采用固相萃取RP柱。

4.根据权利要求2所述同时测定再造烟叶中草酸、琥珀酸、硫酸和磷酸根的离子色谱方法，其特征在于，所述RP柱使用前分别用5 mL甲醇和10 ml纯水以1 mL/min的流速进行活化。

5.根据权利要求2所述同时测定再造烟叶中草酸、琥珀酸、硫酸和磷酸根的离子色谱方法，其特征在于，所述净化处理中所述滤液的流速为0.5 mL/min。

6.根据权利要求1所述同时测定再造烟叶中草酸、琥珀酸、硫酸和磷酸根的离子色谱方法，其特征在于，所述甲基磺酸的浓度为40 mmol/L。

7.根据权利要求1所述同时测定再造烟叶中草酸、琥珀酸、硫酸和磷酸根的离子色谱方法，其特征在于，所述振荡萃取的时间为20～60分钟。

8.根据权利要求1所述同时测定再造烟叶中草酸、琥珀酸、硫酸和磷酸根的离子色谱方法，其特征在于，所述振荡萃取的时间为30min。

9.权利要求1至8任一项所述方法的应用，其特征在于，应用于烟草样品和再造烟叶样品中草酸、琥珀酸、硫酸和/或磷酸组分的测定。

10.权利要求1至8任一项所述方法的应用，其特征在于，应用于再造烟叶中有机酸添加剂中草酸、琥珀酸、硫酸和/或磷酸组分的测定。

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说 明 书

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同时测定再造烟叶中草酸、琥珀酸、硫酸和磷酸根的离子色

谱方法及应用

技术领域

本发明再造烟叶的检测技术领域，更具体地，涉及一种同时测定再造烟叶中草酸、

琥珀酸、硫酸和磷酸根的离子色谱检测方法及应用。

[0001]

背景技术

造纸法再造烟叶因其具有平衡烟草结构，稳定卷烟质量、有效降低焦油和部分有害成分释放量的优势而受到越来越多的利用。造纸法再造烟叶加工过程中，需要加入各种助剂，其中琥珀酸(丁二酸)和草酸作为过程助剂、磷酸作为提取助剂而被加入。基于再造烟叶产品质量稳定和安全考虑，各类助剂的加入量要严格控制，因此需要建立一套准确、有效的测试方法对再造烟叶中的助剂残留进行测试。[0003] 离子色谱法(IC)具有选择性好，灵敏度高，前处理简单的特点而得到广泛应用。烟草及其制品中阴离子、阳离子和有机酸的测定多采用离子色谱法，但未见有报道同时测定再造烟叶中草酸、琥珀酸、硫酸根和磷酸根含量的方法。目前有很多离子色谱法测定包括烟草在内含有维生素C(抗坏血酸)的植物和食品中草酸含量方法，但以上文献均没有考虑维生素C对草酸测定的影响，仅在生物体液医学检测中考虑了维生素C对草酸测定的影响。目前测定烟草中草酸的方法都存在着两个问题：一是以纯水作为萃取液提取草酸的不完全；二是使用碱性较强的NaOH作淋洗液，导致烟草中维生素C(抗坏血酸)转化为草酸而使测定结果偏高。

[0002]

发明内容

本发明要解决的技术问题是，针对现有再造烟叶中草酸、琥珀酸、硫酸和磷酸检测

技术的不足，建立了一种能同时测定再造烟叶中草酸根、琥珀酸根、硫酸根和磷酸根含量的离子色谱方法，旨在对再造烟叶加工过程中化学物质加入量的控制提供技术依据。[0005] 本发明要解决的另一技术问题是提供所述检测方法的应用。[0006] 本发明的发明目的通过以下技术方案予以实现：[0007] 提供一种同时测定再造烟叶中草酸根、琥珀酸根、硫酸根和磷酸根的离子色谱方法，将再造烟叶样品以甲基磺酸作为萃取液振荡萃取后经滤膜过滤，然后进行离子色谱分析；

[0008] 色谱分析条件，分析柱：AS22-4mm；柱温：30℃；淋洗液：4.5mmol/L NaCO3+1.4mmol/L NaHCO3；流速：1.2mL/min；进样量：50μL；抑制器电流：31mA。检测器：自循环阴离子抑制电导检测。[0009] 优选地，在所述离子色谱分析前还包括将滤液固相萃取柱净化处理步骤。由于再造烟叶成分复杂，样品萃取液经过净化去除可能造成色谱柱污染的大分子物质，再进行离子色谱分析。

[0010] 本发明优选采用固相萃取RP柱能有效地过滤杂质成分并有较高的前处理回收

[0004]

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说 明 书

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率。

优选地，净化处理中所述滤液的流速为0.5mL/min。所述RP柱使用前分别用5mL甲醇和10ml纯水以1mL/min的流速进行活化。[0012] 优选地，所述甲基磺酸的浓度为40mmol/L。[0013] 优选地，所述振荡萃取的时间为20～60分钟，进一步优选30min。[0014] 待测四种目标物都是水溶性阴离子，对于离子色谱检测，常用的提取溶剂为纯水、酸溶液和氢氧化钠溶液。但是以用纯水为萃取溶剂为例，其对再造烟叶样品及其一次提取实验总结，草酸的提取效率只有37.7％，无法一次萃取完全。本发明采用40mmol/L MSA能很好的萃取出四种目标离子，在萃取残渣中未检测出草酸，提取效率达到99.7％或以上。[0015] 本发明经过仔细研究总结，优选了AS22作为本方法的分析柱，四种目标成分在该柱上有很好的分离效果；并进一步比较了流动相流速和进样量的影响，流速为1.2mL/min，将进样量提升至50μL能显著提高待测成分的灵敏度，进样重复性RSD达到0.13％～0.7％。

[0016] 本发明方法可以很好地应用于烟草样品和再造烟叶样品中草酸、琥珀酸、硫酸和/或磷酸组分的测定相关组分的测定；并适用于再造烟叶中各类有机酸添加剂中草酸、琥珀酸、硫酸和/或磷酸组分的测定。[0017] 本发明的有益效果：

[0018] 本发明填补了现有技术的空白，提供一种同时测定再造烟叶中草酸、琥珀酸、硫酸和磷酸根的离子色谱检测方法。建立了以碳酸钠-碳酸氢钠混合体系为淋洗液，40mmol/L甲基磺酸(MSA)为提取液，AS22为分离柱的IC测定再造烟叶中草酸根、琥珀酸根、磷酸根和硫酸酸含量的方法。该方法解决了以水为提取液和以NaOH作淋洗液测定草酸含量的不合理性，使样品中的草酸定量更加准确、可靠，不仅如此，应用于同时测定再造烟叶中草酸、琥珀酸、硫酸和磷酸时，各个待测组分测试含量的相对标准偏差(RSD)为0.27％～0.99％，加标回收率在99.3％～106.2％之间，准确、简单、可靠，同时适用于烟草样品和再造烟叶样品中相关组分的测定并适用于再造烟叶中各类有机酸添加剂的测定。

[0011]

附图说明

图1不同浓度NaOH溶液洗脱下维生素C和草酸标准溶液在AS18柱上的分离谱图。

[0020] 其中，谱图1，3，5，7—维生素C标准溶液；谱图2，4，6，8—草酸标准溶液。

[0021] 图2维生素C标准溶液在不同溶剂基质和不同浓度淋洗液条件下产生草酸含量比较结果(ug/mL)。

[0022] 图3不同浓度甲基磺酸萃取液的提取效率比较结果。[0023] 图4不同提取时间测试结果比较结果(峰面积)。

[0024] 图5维生素C在4.5mM NaCO3+1.4mM NaHCO3淋洗液下的色谱图。[0025] 其中，谱图1—维生素C标准溶液；谱图2—四种目标阴离子混合标准溶液。[0026] 图6实际样品测试色谱图。

[0019]

具体实施方式

[0027] 下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明。下述实施例仅用于示例性说明，

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说 明 书

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不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂为常规市购或商业途径获得的试剂，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。

[0028] 材料与方法：[0029] 1.1材料、试剂和仪器

[0030] 本发明以随机选取的26个再造烟叶试验品和成品为例进行说明；水相滤膜(0.45um，希波氏)；固相萃取小柱(RP柱，1cc，美国戴安)；色谱分析柱(AS22-4mm，美国戴安)。

[0031] 甲基磺酸(MSA)(99％，美国Fluka公司)；无水碳酸钠(基准品，天津红岩试剂厂)；碳酸钠(100％，pure chemical Analysis Co.Ltd)；维生素C(抗坏血酸)(99％，美国Sigma-Aldrich公司)；草酸(99％，美国Acros公司)；磷酸根、硫酸根标准溶液(1000ug/ml，国家标准物质中心)；六水琥珀酸(99％，美国Sigma-Aldrich公司)；超纯水(电阻率≥18.2MΩ·cm)。

[0032] ICS5000离子色谱仪(美国戴安公司)；Milli-Q超纯水仪(美国Millipore)；CP224S电子天平(感量0.0001g，德国Sartorius公司)；HY-5振荡器(国产江苏)。[0033] 实施例1维生素C对草酸测定的影响实验

[0034] 目前很多包括烟草在内含维生素C的植物中草酸含量测定的离子色谱法都是使用NaOH溶液作为淋洗液分离草酸根及其他阴离子。本研究发现维生素C在高pH下能转化为草酸。以水为溶剂配制100ug/ml维生素C标准溶液，在AS18阴离子分析柱上分别用10mmol/L、20mmol/L、30mmol/LNaOH溶液等度洗脱和11mmol/L～50mmol/LNaOH溶液梯度洗脱作为流动相程序，测定维生素C标准溶液，在测试色谱图上均有草酸根出峰(保留时间定性，见图1所示)。图2所示为采用纯水和甲基磺酸两种溶剂基质下配制的100ug/mL维生素C标准溶液在不同浓度NaOH溶液洗脱时产生草酸的量。以上结果表明：大约有50％维生素C转化为草酸，因此在测定含有维生素C的样品中草酸含量时不能使用NaOH作为提取液和淋洗液，否则，会造成测试结果草酸含量偏高。[0035] 实施例2样品前处理方法的研究实验[0036] 待测四种目标物都是水溶性阴离子，对于离子色谱检测，常用的提取溶剂为纯水，酸溶液和氢氧化钠溶液。由于2.1的原因不能使用强碱性溶液提取。试验用纯水为萃取溶剂对再造烟叶样品及其一次提取后的残渣进行30分钟震荡提取，测定四种目标成分。结果表明采用纯水为萃取剂，草酸的提取效率只有37.7％，无法一次萃取完全。由于该方法所用的分析柱为阴离子柱，常用的酸根离子会带来阴离子干扰，因此试验采用了不同浓度甲基磺酸(MSA)为萃取溶剂。结果表明(见图3所示)：采用40mmol/L MSA能很好的萃取出四种目标离子，在萃取残渣中未检测出草酸，提取效率达到99.7％。[0037] 以40mmol/L MSA为萃取溶剂，研究了不同振荡时间对测试结果的影响，结果表明四种目标成分测试结果在20～60分钟振荡时间内差异不大，综合各种因素，确定最佳时间为30分钟(见图4所示)。

由于再造烟叶成分复杂，样品萃取液需要经过净化去除可能造成色谱柱污染的大

分子物质，再进行离子色谱分析。实验表明固相萃取RP柱能有效地过滤杂质成分并有较高的前处理回收率。

[0038]

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说 明 书

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实施例3色谱条件的确定实验

[0040] 基于本发明长期研究实验总结以及前述原因，不能采用NaOH溶液作为淋洗液，试验探讨了使用NaCO3+NaHCO3作为流动相的可能性，结果表明(见图5)，采用4.5mmol/L NaCO3+1.4mmol/L NaHCO3作淋洗液，维生素C标准溶液没有转化为草酸。试验同时研究考察了多种色谱柱，例如AS14、AS22等色谱柱，从分离度、峰形对称性、峰宽和灵敏度等多个因素进行比较分析，优选确定AS22作为本方法的分析柱，四种目标成分在该柱上有很好的分离；比较了流动相流速和进样量的影响，流速为1.2ml/min，将进样量提升至50μL能显著提高琥珀酸的灵敏度，进样重复性RSD达到0.13％～0.7％。[0041] 实施例4干扰离子研究试验[0042] 本发明同时考察了烟草中氟、氯、硝酸、亚硝酸根等常见阴离子和甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、苹果酸、丙二酸以及再造烟叶特有的富马酸等有机酸对实验的影响。结果表明氟、氯、硝酸、亚硝酸根和甲酸、乙酸、丙酸、乳酸都集中在10min前出峰，苹果酸丙二酸和富马酸同时在硫酸根和琥珀酸中间出峰，与待测物有良好的分离(见图6所示)。[0043] 实施例5确定工作曲线和检出限

[0044] 分别使用40mmol/L MSA配制标准溶液，四种目标成分中的草酸根和琥珀酸根离子在MSA基质下成线性响应，但硫酸根和磷酸根在MSA基质下则为二次曲线响应。[0045] 分别使用1000ug/mL的磷酸根、硫酸根、琥珀酸根和草酸根标准储备液，配制成表1的系列标准工作溶液，进行离子色谱分析。以目标物的峰面积(Y)对其响应的浓度(X，ug/mL)进行拟合回归。取系列标准溶液中最低浓度的标准溶液点，连续进样10次，计算标准偏差(SD)，以3倍SD为方法的检出限。回归方程、相关系数和检出限见表2所示。[0046] 表1混合标准工作溶液浓度(ug/ml)

[0047]

[0048] [0049]

表2回归方程、相关系数和检出限

[0050] 实施例6回收率和精密度实验

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说 明 书

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准确称取再造烟叶样品，按照本发明方法进行测定，每个样品重复5次，结果表明(表3所示)，样品目标成分含量相对标准偏差(RSD)为0.27％～0.99％，说明方法的重复性较好。取已知含量的样品溶液，分别加入三个浓度水平的标准溶液进行IC分析，计算回收率，结果显示(表4所示)，回收率在99.3％～106.2％之间，说明方法的准确度较高，可以满足定量分析的要求。

[0052] 表3方法重复性测试结果(n＝5)

[0053]

[0054] [0055]

表4方法加标回收率

实施例7样品前处理和色谱分析

[0057] 根据GB/T19616和YC/T 31-1996制备试样和测定样品水分，准确称取0.1g样品(精确至0.0001g)于150mL磨口三角瓶中，加入50.0mL40mmol/L MSA萃取液，盖上塞子，置于振荡器上，振荡萃取30min。样品溶液经滤膜过滤，滤液再以0.5mL/min的流速经RP固相萃取柱净化(RP柱使用前分别用5ml甲醇和10ml纯水以1mL/min的流速进行活化)，最后进行离子色谱分析。

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说 明 书

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色谱分析条件，分析柱：AS22-4mm；柱温：30℃；淋洗液：4.5mmol/L NaCO3+1.4mmol/L NaHCO3；流速：1.2mL/min；进样量：50μL；抑制器电流：31mA。检测器：自循环阴离子抑制电导检测。

[0059] 采用本方法对26个随机选取的再造烟叶中试样品及烟草成品样品进行测定，结果见表5所示。MSA提取液可能含有少量的硫酸根和磷酸根离子，必要时进行空白试验扣除。本发明方法同时适用于烟草的测定。[0060] 表5实际样品测定(mg/g)

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说 明 书

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本发明建立了以碳酸钠-碳酸氢钠混合体系为淋洗液，40mmol/L甲基磺酸(MSA)为提取液，AS22为分离柱的IC测定再造烟叶中草酸根、琥珀酸根、磷酸根和硫酸酸含量的方法。该方法解决了以水为提取液和以NaOH作淋洗液测定草酸含量的不合理性，使样品中

[0063]

的草酸定量更加准确、可靠，适用于再造烟叶中各类有机酸添加剂的测定。

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说 明 书 附 图

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图1

图2

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说 明 书 附 图

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图3

图4

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说 明 书 附 图

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图5

图6

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