基质金属蛋白酶组织抑制因子1对小鼠成纤维细胞增殖和细胞外基质的影响

３ｌ２　中华结核和呼吸杂志２００２年５月第２５卷第５期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｔｕｂｅｒｃｌ￣ｅｓｐｉｒ　Ｄｉｓ，ｈ　２００２，Ｖｏ１　２５　Ｎｏ　５　论著摘要．　基质金属蛋白酶组织抑制因子１对小鼠　成纤维细胞增殖和细胞外基质的影响　昊泰华林洪丽朱正美　肺纤维化的主要病理改变为肺成纤维细胞（ＬＦ）聚积和　细胞外基质（ＥＣＭ）积聚。【Ｆ在肺纤维化过程中有着重要的　作用　【Ｆ几乎能合成全部有ＥＣＭ降解活　的基质金属蛋白　酶（慨）及其抑制剂（Ｔ１ＭＰｓ），特别是Ｔ１ＭＰ－Ｉ＿ｌ，当ＬＦ在静　止状态下只能音成较低水平的ＴＩ＿ＭＰ－Ｉ，但其被激活后表达　合成并分泌大量的Ｔ１ＭＰ－Ｉ，阻止ＥＣＭ的降解　特别是其中胶　原的降解，从而促进肺纤维化的形成和发展　因此，我们将　人的正义和反义Ｔ１ＭＰ－ｌ（ｈ　ｌＩＭＰ一¨全长ｃＤＮＡ导八小鼠成纤　维细胞（Ｎ１Ｈ３Ｔ３细胞）中以期观察其对ＮＩＨ３Ｔ３细胞增殖丑　细胞外基质成分表达的影响　材料与方法　ｃ１）正义（Ｐｒｓ）及反义（ＰＴａｓ）ＴＩＭＰ－１重组　真核表达载体由中国人民　医院肾科，全军肾脏病重　点实验室陈香美教授惠赠【　。（２）ＰＴｓ丑Ｐｒ缸转染ＮＩ｝Ｄ　：　常规方法进行ＮＩＨ３Ｔ３的培养　分为对照、空载体转染、ＦＦｓ　转染和ＶＩ＇ａｓ转染四组一脂质体转染法转染：（３）ＰＣＲ检测　１３１５＇Ｏ基因及人Ｔ１ＭＰ－ＩｃＤＮＡ在ＮＩｍＩ３上的整合　（４）Ｎｏｒｔｈ㈣　ｂｌｏｔ检测Ｎ１Ｈ３Ｔ３内源的ＴＩＭＰ－１、ＭＭＰ－２，ＭＭＰ－９、Ⅳ型胶原的　表达：２０　各组细胞的总ＲＩｇＡ，用以翌Ｐ标记、随机引物法制　备的小鼠ＴＩＭＰ－１、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９、Ⅳ型胶原探针进行杂交　一７０＇Ｅ自显影。ｒ５）细胞生长速率测定：分别将四组细胞以　５　０（３０个／ｍｌ的密度传代于２４孔板．每１３计数细胞　单因素　方差分析计数结果一（６）ＥＬＩＳＡ测定细胞培养基中ｎ、ｌ、　Ⅲ及Ⅳ型胶原：结果均以均值±标准差表示．所得数据用ｆ　检验处理　结果　（１ｊ　ｒ　基因及人ｍｌ在ＮＩＶ￣Ｔ３上的整台：　ＰＣＲ扩增ｐｌＪｘ矾载体上的ｌｑｅＯ序列，无外源基因转染的正常　ＮＩＩ￣Ｔ３未见阳性条带：空载体、ＦＦｓ及Ｐｒ扭转染的ＮＩＩ￣Ｔ５　均见７９０　ｂｐ的阳性条带（固１）　扩增ＮＩＶ￣Ｔ３上的人ＴＩ￣Ｗ－　ＩｃＤＮＡ．无外源基因转染及空载体转染的ＮＩＨ３Ｔ３未见阳性　条带。ＦＦｓ及Ｉ１　转染的ＮＩＨ３Ｔ３均见６５２　ｂｐ的阳性条带　（图１）。（２）Ｉ￣ＪＰ－】转染对ＮＩＨ３Ｔ３细胞增殖的影响：ＦＦｓ转　染组在细胞生长２４　ｈ后邸开始显示出显著的促细胞生长作　用．与对照组及空载体转染组相比，差异有显著眭（２　６１±　０　ｌ８　ｖｓ　１　７３±０．１２，Ｐ＜０　０１），ＦＦａ．￣转染组与对照组相比　第三天开始显示出显著的抑制细胞生长作用（４　５２±０．３９　ｓ　基金项目：　宁省教育委员会基金资助项｝１（９９０２２１０６６）　作者单位：１１６０１１大连医科丈学附属第　医院呼吸内科（吴泰　华）．泌尿内科（林洪丽、：大连医科大学生物化学教研室（朱正美）　５　ｂＤ　（＾）　■＿　＿　１　Ｍａｒｋｅ￣．２对照组，３李载体转染对照组，４　ＰＴｓ转　染组．５　Ｈ　转染组　圈１　ＰＣＲ扩增ＮＪＨ３Ｔ３细胞基因组ＤＮＡ中　岫　（Ａ）及ｈＴＩＭＰ－１（Ｂ）ｃＤＮＡ序列　Ⅳ胜原　１未转染对照组，２空载体转染对照组．３　Ｐ　转染　组．４　ＰＴ　转染组　图２　ｌＦ义、反义Ｔ１ＭＰ－！基因对细胞Ⅳ胶原删Ａ、　ＭＭＰ－２ｎｄＵ￣Ａ、ＭＭＰ一９ａｕ￣ｄ￣Ａ、Ｉ１ＭＰ－ＩｒｏＲＮＡ表选的影口向　５　３６±０．４６．Ｐ＜Ｏ　Ｏ１），对照组及空载体转染纽相比差　维普资讯 http://www.cqvip.com

呼哦杂志２００２年５』】第２５卷第５期Ｃｈｉｎ』Ｔｕｂｅ￣：Ｒｅｓｐｉｚ　Ｄｉ　Ｌ　Ｍ｝　型堡ｌＩ世　—　』　袁１细胞培养基中Ｉ＂Ｎ、　、Ⅲ、Ⅳ型胶原的ＥＬＩＳＡ测定值（Ａ值，　±　）　组别　对照组　样本数　ＦＮ　Ｏ．３０±０　０４　０　３２±０∞　０　６０±０　０７　０　Ｉ８＝０∞　Ｉ型脏　Ｏ　ｌ８８±０　Ｃｒ２９　０　Ｉ７２±０　０４１　０　４７９±０　０４８　ｃ　ｌｌＯ３±０　０Ｉ【　叮型脏原　０　３９±０．０７　０　３７±Ｏ船’　０　７７±０１１’　０　ｌ９±０　０４　Ⅳ型胶原　０　１３２±０　０１１　０１３９±０　００９　０　３８３±０　。　空载体组　ＰＴｓ组　Ｐｒ　组　０［丌ｌ±０　Ｏ０４。　注：空载体组、ＪＪＪｓ组　ｒ‰虹分别与对删缎柜比较，　Ｐ≥０　０５’　Ｐ≤０　０　异无显著性。（３）对细胞Ⅳ胶原ｆ　ｎ【）ｍＲＮＡ、、ＩＭＰ－２ｍＲＮＡ、　ＭＭＰ－９ｎＬ！￣ＮＡ、ＴＩ￣ＩＰ－ｌｍＲＮＡ表这的影响：如图２所示．Ⅳ胶原　（０１１ｍＲＮＡ、ＭＭＰ－２ｍＲＮＡ、ＭＭＰ－９ｍＲＮＡ在对照组、空载体转　染组、Ｐｌ＇ｓ转染组、ＰＴａｓ转染组均有表达，各组之间无明显差　用。我们的实验也证实了转染了反义ＴＩ￣Ｉ．Ｐ－１基因的细胞有　反义ＲＮＡ的存在，并证实外源性反义ＲＮＡ能使内源性靶　ｒｎＲＮＡ表述降低：我们的结果还表明转染反义ＴＩＭＰ－１基因　通过抑制内源性ＴＩＭＰ－１的表达，减弱或解除其对ＭＭＰｓ的抑　制．使ＭＭＰｓ活性增加、降解细胞外基质的能力增强，导致细　胞培养摹中ＥＣＭ降低｛而转染正义ＴＩＭＰ－１基因，外源ＴＩＭ］Ｐ－　１的表达增高，使ＭＭＰｓ活性降低　降解细胞外基质的能力减　弱　导致细胞培养基中ＥＣＭ增高。反义ＴＩＭｌＰ－１的这种作用　异：ＴＩＭＰ－ＩｕｔＲＮ￣ｉ在埘照组、宅载体转染组、ＰＹｓ转染组、丌缸　转染组均有表达、ＰＴａｓ转染组表达明显减弱　（４）ＴＩＭＰ－１转　染对Ｎ　细胞培养基中ＭＭＰ－２、ＭＭＰ　９及ＦＮ及Ｉ、Ⅲ、Ⅳ　型胶原的影响：空载体组与对照组相比．　和Ｉ、Ⅲ、Ⅳ型胶　原含量差异无显著性（Ｐ＞０．０５）、ＰＹｓ组　对照组相比，ＦＮ受　Ｉ、Ⅲ、Ⅳ型胶原含量明显增岛（Ｐ＜０　０１ｊ．而ＰＴ　组与对照　为进一步应用反义ＴＩＭＰ－１对肺纤维化进行基因治疗提供一　定的实验基础　参Ｓｅｌｒ￣组相比，　皿１、１１ｌ、Ⅳ型胶原含量明显降低【Ｐ＜０　０１，表　１）。　考文献　讨论Ｔｎ　．１是个重要的多功能因子．参与细胞外基　Ｍ．Ｒｕｉｚ　Ｖ，（￣ｂｒｅｒａ　Ｓ、ｅｌ　ａｌ＇１１ＭＰＩ，一２，－３，ａｎｄ＿４　ｉｎ　ｉｂｒｆｏｓｉｓ　Ｉ　Ｊ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ａ　ｐ　ｍｌ　Ｉ】ｇ　ｎｏｎｄｅｇｒａｄａｔｉｖｅ　ｌｕｎｇ　Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌ　Ｐｈ　ｄ．２００Ｏ，２７９　质代谢和细胞生ｌ乇、增殖以及凋　的多种生理和病理过程　因此弄清ＴＩＭＰ－ｌ在肺纤维化过程中的作用及机制有着重要　的意义。我们通过基因转染的方法将ＴＩＭＰ－１转染至ＮＩＨ３１＂３　ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ　Ｐ　～ｌ　５６２－５７４　细胞，结果进　步表明内源１生ＴＩ￣ＩＰ【高教表达可以显著促　进ＮＩＨ３Ｔ３细胞的增殖，反义的　１町眦显著抑制　ＮＩＨ３Ｔ３细胞的增殖，说明了ＴＩ￣ＩＰ－【对细胞有刺激其增殖作　２林洪丽，陈香美．于志恒．等人ＴＩＭＰ－１　ｃＤＮＡ克隆、真棱表达载　蚌构建受在ＣＯ６－７细瞧中　表达中国牛物化学与分子生物学　报、２００）１６：３０６　３１１　（收稿日期：２００１４３７一【２）　（本文编辑：韩锟）　．简讯．　第二届全国睡眠呼吸障碍专题研讨会征文通知　为了进　步推动全国睡眠呼吸障碍疾病防治Ｔ作，深化对于睡眠呼暇障碍疾病的认识　中华医学会呼吸病学分会拟于　２００２年１１月下旬在广州市召开第二届全国睡眠呼嗳障碍专题研讨会，现将会议征文内容和要求通知如下。　征文内容：ｃ１）睡眠呼吸暂停低通气综合征（　括呼吸中枢驱动　病理生理学研究Ｊ的流行病学调查　（２）ＳＡＩＬＳ的病因学研究。（３）ｓＡ｝璐的发病机制，包　（４）ＳＡＩＬＳ的诊断方法学与诊断标准探讨、鉴别诊断。（５）ＳＡＨＳ对全身其它脏器、系统的　影响（心血管．中枢神经、内分泌、生殖）、及与其他系统的关系　【６１　ＳＡＨＳ药物治疗，包括中医中药治疗研究　（７）Ｓ．￣ＩＳ的持　续气遭内正睚（ＣＰＡＰ１、ＢｉＰＡＰ治疗方法嚣果　（８１　Ｓ．ＺＨＳ的手术治疗‘耳鼻咽喉、口腔Ｊ适应证、方法、效果。（９１　Ｓ＆ＨＳ的自然　病程、随访、治疗顺应性、预后研究。（１０）其它睡眠呼吸障碍疾病　ｌ１１　Ｊ与睡眠相关的其它呼嗳系统疾病。（１２）儿童睡眠呼　吸障碍研究　（１３）相关新技术的发展与应用一　征文要求：（１）必须是未在止式杂志上公开发表的论文一（２　Ｊ　４　０００字左右全文１份，１　０００字以内非结构式摘要２份，并附　软盘（以ｗｏｒｄ或纯文本存盘）。（３）注明作者详细通讯地址、邮编、电话（单位、住宅）受Ｅ－ｍａｉｌ　４）加盖公章，并在信封上注明　“睡眠呼吸障碍会议征文’　会议将给正式代表颁文证＃和继续教育学分证书：截稿日期为２００２年７月【日ｆ　邮戳为　准）　来稿请寄北京市东四西大街４２号中华结核和呼吸杂志编辑部．邮编１００７１０。欢迎大家踊跃投稿、包括心血管、神经科、消　化科、耳鼻咽喉科　口腔科、生殖、内分泌、放射科、中医科等关心此病的专家学者