发酵工程实验报告一

发酵工程学实验

姓名： 刘云谣 学号： 124120434 学院： 生命科学学院 专业、班级： 12生物技术 实验课程名称＿ 发酵工程实验 指导教师及职称 唐湘华 开课学期 2014 至 2015 学年 下 学期

云南师范大学教务处编印

实验名称：实验一、根霉曲的制备、实验二、根霉曲糖化能力的测定 实验时间 第三四周 小组合组 是 一、 实验目的： 1、掌握固体发酵的基本操作步骤 2、了解根霉曲制作工艺和基本原理 3、了解糖化酶的测定方法 4、对糖化酶的糖化产物及糖化DE的计算 5、了解根霉曲在发酵生产过程中主要应用依据 二、 实验原理： 1、通过固体发酵，根霉在麦麸培养基中进行大量繁殖，产生淀粉酶和糖化酶复合酶系； 2、通过淀粉酶的液化和糖化酶的糖化作用将淀粉转化为还原单糖. 3、淀粉是由葡萄糖通过α-1,4糖苷键构成的直、链淀粉和α-1,6位有分支的支链淀粉组成的，直链淀粉约含100-6000个葡萄糖单位，支链淀粉平均含6000个以上的葡萄糖单位，最高可达300万。 4、淀粉酶首先酶解淀粉为小分子的糊精、寡糖和少量单糖； 5、通过糖化酶的作用将小分子的糊精和寡糖降低为还原性的单糖。 实验室 小组成员 睿智3-121 三、 实验材料 麦麸、 根霉AS3.866 、天平、烧杯、三角瓶、灭菌锅、超净工作台、培养箱等、根霉、柠檬酸缓冲液、DNS、1%淀粉、水浴锅、离心机、722分光光度计等。 四、 实验方法、步骤及注意事项： （一）根霉曲的制备 1、培养基的配制与灭菌（约60%含水量） 麦麸20g＋约20ml水 /2人 →放入烧杯拌匀（以组为单位）→ 分装于三角瓶→包上纱布（至少6层）→包牛皮纸（一层）→包 扎→ 120℃灭菌1h →摇动打散瓶内培养基→冷却至约30℃ 2、接种（ AS3.866 ） 液体接种，接种量5% →无菌操作进行接种→摇 匀 → 在瓶壁上写上姓名、接种日期 3、培养 接种后的三角瓶倾斜平放 → 28℃培养24h → 扣瓶 （本周三中午）→ 继续培养约24h →出料（烘干、磨碎）→根霉曲 （二）根霉曲糖化能力的测定 1、绘制标准曲线的方法  先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分别测定它们的吸光度A。  以A为横坐标，浓度c为纵坐标，则得到一条拟合度较好的直线，称为标准曲线。  然后使用用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲线上找出对应的被测溶液浓度或含量。 0.1%葡萄糖标准曲线的制作 取7支试管，编号，按照下表进行操作： 葡萄糖溶液 体积（ml） 葡萄糖含量（mg） 缓冲液（ml） DNS (ml) 定容总体积(ml) OD（540nm） 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 0.0 2.0 3 15 0.2 1.8 3 15 0.4 1.6 3 15 0.6 1.4 3 15 0.8 1.2 3 15 1.0 1.0 3 15 1.2 0.8 3 15 2、酶液的制备 取1克根霉曲溶解到30毫升缓冲液中，混合搅拌10分钟，纱布过滤，取过滤液备用。 3、糖化酶酶活测定 取酶液按照下表要求操作测定酶活 操作步骤 空白管 样品管A 样品管B 步骤1 吸取1.8mL淀粉底物溶液 吸取1.8mL淀粉底物溶液 吸取1.8mL淀粉底物溶液 步骤2 步骤3 50℃保温5分钟 50℃保温5分钟 加入待测酶液0.2毫升 50℃保温5分钟 加入待测酶液0.2毫升 步骤4 50℃精确保温10min 加入3mLDNS试剂终止反应 混合均匀 加入0.2毫升待测酶液，沸水浴煮沸5min 流水冷却 加蒸馏水10mL，混匀 OD540nm比色 50℃精确保温10min 加入3mLDNS试剂终止反应 混合均匀 50℃精确保温10min 步骤5 加入3mLDNS试剂终止反应 混合均匀 步骤6 步骤7 沸水浴煮沸5min 沸水浴煮沸5min 步骤8 流水冷却 加蒸馏水10mL，混匀 OD540nm比色 流水冷却 步骤9 加蒸馏水10mL，混匀 步骤10 OD540nm比色 OD =（A+B）/ 2 4、淀粉酶的液化效果试验 取一只试管装入1毫升1%浓度的淀粉底物，50℃ 预热5分钟，加入酶液1毫升，反应5分钟，取5毫升 稀碘液检测淀粉显色情况。 5、记录试验现象和注意事项  试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落；  移液枪的使用：向试管内加入待测酶液或DNS时，枪头不要触碰管壁，也不要伸入液面下，连续吸取同一种溶液时可以不用更换枪头！  精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；  避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时； 五、 实验结果分析： （一）0.1%葡萄糖标准曲线的制作 葡萄糖溶液 体积（ml） 葡萄糖含量（mg） 缓冲液（ml） DNS (ml) 定容总体积(ml) OD（540nm） 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 0.0 2.0 3 15 0 0.2 1.8 3 15 0.086 0.4 1.6 3 15 0.305 0.6 1.4 3 15 0.576 0.8 1.2 3 15 0.661 1.0 1.0 3 15 0.942 1.2 0.8 3 15 1.177 根据表格的数据得到下图 （二）DE值的计算 经过紫外分光光度法的测量得到A、B的OD540值为 A：1.061 B：1.144 取平均值得：(A+B)/2=(1.061+1.144)/2=1.1025 根据公式 E酶活力单位（U/ml）= {K[ (ODA + ODB ) /2] + b}×5×10×1000/10/0.2/1/180 将 y=0.9998x-0.0646代入得出 E=60*(1.1025*0.9998-0.0646)*5*10*1000/10/0.2/180=8647.33U/ml （三）淀粉酶的液化效果试验 因为试管中的淀粉底物都被酶液中的酶分解完全了，淀粉酶首先酶解淀粉为小分子的糊精、寡糖和少量单糖，通过糖化酶的作用将小分子的糊精和寡糖降低为还原性的单糖，试管内已经没有淀粉了，碘液只有遇到淀粉才变蓝，所以最终试管内液体不变蓝。 六、实验总结 通过本次实验，我掌握固体发酵的基本操作步骤；学会了霉曲制作工艺和基本原理；学会计算DE值。在本次试验中有小成，也有不足，比如说在精确计时时记录的不是很精确，小组的分工上也不是很合理，还有做实验时有点小粗心，会在今后的实验中改正。 七、教师评语及评分： 签名： 年 月 日