第十一章讲义－酵母基因工程

目前已能够利用基因转移方法研究哺乳动物细胞基因功能，但操作哺乳动物细胞基因组的能力还非常有限。例如，虽然能把修饰过的基因较容易地导入哺乳动物细胞内，但却不能保证这些基因的是正确的。而且内源野生型基因的存在，使得对修饰过基因的研究变得错综复杂。利用目前的技术，要把一个野生型基因从哺乳动物细胞基因组中剔除还非常困难。 人们能利用一种不寻常的实验生物，即面包酵母(Saccharomyces cereviae)来弥补研究中的缺陷。面包酵母以及它的远亲种粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)常被微生物学家用来作为研究材料，这是因为它们具有一些十分诱人的生物学特性，使得其操作如同细菌一样容易。首先，它们生长迅速，大约两个小时增殖一代。这意味着在两天时间里培养皿中可长出成千上万的克隆酵母菌落。而哺乳动物细胞增殖一代最快也要16～24h，要获得足够的试验用细胞数量，就需要花费2至3周的时间进行精心培养细胞。第二，酵母的基因组非常小，比大肠杆菌的基因组仅大几倍，要比哺乳动物细胞的基因组小200倍，这使得遗传分析和分子分析的工作量大大减小。例如，要建造一个酵母基因组文库仅需要几千个质粒或噬菌体就足够了，而要建造一个完整的哺乳类基因文库需要上百万个质粒或噬菌体。第三，酵母特别适用于进行遗传分析，这是因为细胞既能以单倍体形式存在，又能以二倍体形式存在。这样，遗传上的隐性突变利用单倍体细胞就非常容易获得，而作为遗传学家基本工具的遗传互补可简单地用两种不同类型的单倍体突变体交配而获得。哺乳动物细胞是二倍体(有时甚至更复杂)，使其中的隐性突变根本不可能被发现。

作为真核生物，酵母在组织结构上与更复杂的生物更加相像，许多酵母蛋白在结构与功能上与哺乳动物细胞密切相关，这方面的认识大大激发了人们研究酵母的兴趣。因此，通过对结构简单的酵母的研究，可以加深对哺乳动物细胞功能的了解。本章将介绍如何对酵母基因组进行实验操作以及通过酵母菌来研究复杂的细胞过程的一些试验。

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1 酵母基因的克隆

目前已研究出多种克隆酵母基因的方法，常用的有大肠杆菌突变互补法、利用穿梭质粒克隆酵母基因和基因互补法等。

1.1.1 利用大肠杆菌突变互补法克隆酵母生物合成基因

遗传标记(如抗药性)可用来在群体中鉴别出引入DNA的稀有细胞。在酵母中作用的遗传标记的获得是使酵母基因组能进行重组DNA操作的一个突破。第一个酵母遗传标记是编码氨基酸和核苷酸生物合成酶的基因。之所以能获得这些基因是因为它们能与大肠杆菌生物合成途径中的突变体互补。如酵母亮氨酸合成途径中编码β-异丙基苹果酸脱氢酶的leu2基因，能够互补大肠杆菌突变体中缺乏这种酶的基因。用携带酵母DNA的质粒文库转化大肠杆菌突变体，并简单地选择能够恢复缺失功能的质粒，可将这类酵母基因克隆。下图所显示的是克隆酵母leu2基因的方法。用传统方法构建酵母染色体DNA质粒文库，并用此文库转化大肠杆菌leuB突变株。这种突变株缺乏由lwu2基因编码的在亮氨酸生物合成过程中需要的β-异丙基苹果酸脱氢酶。细菌吸收携带leu基因的质粒后能充分表达leu2基因，使其在缺乏亮氨酸的培养基中生长。从这种细胞中提取质粒，从而将质粒上克隆的leu2基因筛选出来。

野生型的leu2基因一旦克隆，就可用来互补缺乏这一基因的酵母突变体。像大肠杆菌leuB突变体一样，酵母leu2突变体不能合成亮氨酸，因而不能在缺乏亮氨酸的培养基中生长。携带leu2基因的质粒能用类似于转化细菌的方法转化进酵母中。当酵母在缺乏亮氨酸的培养基中培养时，只有那些获得克隆基因的细胞能够生长并形成菌落。虽然被转化的细胞也能接受来自质粒的其他基因，但只有携带leu2基因的质粒能使leu2突变体在缺乏亮氨酸的培养基中生长。因此，就像细菌质粒中的氨苄青霉素抗性基因可用来选择大肠杆菌转化子一样，leu2基因也可作为酵母leu2突变体中准确的选择标记。现在许多通常便用的酵母菌株都携带有多个生长合成基因的染色体突变，因而可使用几个不同的遗传标记。

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1.1.2 穿梭质粒在大肠杆菌和酵母中的复制

重组DNA技术在酵母上的第二个突破是既能在大肠杆菌中复制又能在酵母中复制的质粒载体的构建。这种载体既可通过传统的DNA重组方法对质粒进行基因工程操作，使其像其

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他质粒一样在细菌中繁殖，又可重新放入酵母中研究。这种质粒被称作穿梭质粒(shuttle vector)，它必须含有在细菌和酵母中都起作用的选择性标记和DNA复制起点。现代的穿梭质粒除了带有酵母选择标记基因外，通常携带绝大多数克隆载体都具有的氨苄青霉素抗性基因。所有的现代穿梭质粒所用的细菌复制起点也都来源于标准的实验室克隆载体。

研究人员根据每个酵母细胞所要获得的质粒数目的不同，在穿梭质粒中选用了几种不同的酵母复制因子(图9-3)。最简单的酵母载体为整合质粒，它携带有为它提供复制起点的细菌质粒序列(此处为质粒pUC118)、在大肠杆菌中生长的抗药性基因、在酵母中转化子选择性标记基因(此处为leu2)以及为插入新序列的性酶切位点。通过直接整合入染色体，酵母能稳定地获得这种质粒。复制载体以自由的环状质粒存在于酵母中。为这种载体提供复制起点的一个例子是2μm DNA环，它的复制起点来源于酵母的天然质粒。另一为复制载体提供细胞复制起点的是自主复制序列(ARS)。含有ARS的载体加上着丝粒序列后大为稳定，在细胞中能保证质粒的稳定分配。着丝粒序列也使质粒的拷贝数在每个细胞保持在1～2个。酵母人工染色体(YACs)含有着丝粒和位于两端的端粒，使YAC能像小的线性染色体一样复制。YAC能携带几十万个碱基的DNA，使其适合特殊基因组的作图。缺乏酵母复制起点的载体叫做整合载体(integrating vector)，因为细胞想要稳定表达标记基因并形成菌落的唯一方式是将质粒直接整合到酵母染色体上。2μm DNA环是从酵母天然质粒中分离出的酵母复制起点，若它位于酵母染色体DNA上，则被称作自主复制序列 (autonomously replicating sequence, ARS)。载体上的2μm DNA或ARS序列能使该载体在酵母细胞中复制，拷贝数可达十多个。携带2μm DNA序列的质粒在酵母中通常相当稳定，也就是说它们在有丝中能有效地传递给子细胞；而含有ARS的质粒在有丝中却不能有效地传递，如果对质粒上的标记没有持续地进行遗传选择的话，质粒就会丢失。

如果给含有ARS的质粒上加上着丝粒 (centromere)序列(即CEN序列)，它就会大为稳定。每条染色体上都含有着丝粒序列，它可使染色体在有丝和减数中稳定复制，并使其准确地分配到子细胞当中。含有CEN因子的质粒不但极其稳定，而且在酵母中的拷贝数能严格保持与染色体数目等同，通常为一个或两个，因此，研究人员通过选择2μm DNA质粒或CEN质粒，就可相应得到多拷贝的基因或与单倍体染色体相等的一个基因。基因的拷贝数高意味着基因产品的高表达。因此，要过量表达酵母基因，只要将这些基因装载入拷贝数高的质粒中就可以了。这一点是将要讨论的许多基因工程试验的基础。

酵母人工染色体(yeast artificial chromosome-YAC)是由CEN载体发展而来的。它比 CEN载体增加了位于染色体末端称作端粒(telomere)的序列。YAC末端的端粒能使它自

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身像线性染色体分子那样复制。虽然YAC在常规克隆试验中不常用，但它对外源基因非凡的容纳能力(几十万个碱基对)使其成为大型基因组物理特性研究方面极为重要的工具。

1.1.3 用简单的互补法克隆酵母基因

在有可供选用的探针时，虽然有时酵母基因也可通过传统的杂交法克隆，但经常是根据酵母基因能够弥补突变株缺陷的能力而将其直接克隆。这种利用遗传互补进行基因克隆的方法与利用leu2标记的过程完全相同。由于在酵母中复制的可供选择的克隆载体有多种，再加上酵母的基因组很小，使得通过互补克隆酵母基因相当简单。因为有些必需基因的失活是致命的，所以这些基因经常通过条件致死突变进行检测。一种常见的类型是温度敏感(ts)突变体，它在低温(许可温度)下生长，但却不能在高温(非许可温度)下存活。温度敏感表现型通常是基因发生无义突变从而使它编码的蛋白质在较高温度下不稳定或者失活而产生的。ts突变体中损坏的野生型基因如图9-4中的基因X，通过遗传互补很容易克隆。将质粒文库转化进同时含有leu基因突变的ts突变株中，转化后的细胞培养在许可温度(30℃)并缺乏亮氨酸的培养基中，选择出获得质粒的菌落(所有质粒都携带有leu基因)。通过影印平板技术将菌落转移到第二个盘子中在37℃下培养。由于突变基因失活，因此只有获得携带野生型基因X的质粒的菌落才能存活。从存活的菌落中分离质粒，即可获得克隆的野生型基因。有时这种方法可分离到称作抑制基因（suppressor)的不同基因，这是因为它具有相关功能，

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所以可抑制突变体的表现型。

一旦某一感兴趣的缺陷型酵母突变体被分离出来，就可用携带酵母基因组DNA片段的质粒文库转化这一突变体。由于酵母基因组仅装载在几千个质粒上，因此，利用影印培养法可以非常容易地进行遗传选择。如果突变体的缺陷能被质粒上的野生型基因(有时是相关基因)所弥补，就能将酵母转化子筛选出来。这种转化子一经发现，就可将质粒直接从细胞中提取出来，并转化进大肠杆菌中扩增。

下图所反映的是影印培养技术。影印培养法可使研究人员快速地将酵母菌落从一个平板转移到另一个平板进行遗传分析。使酵母菌落先在一个平板上生长。紧贴培养基盖上一个消毒过的丝绒布，这时酵母会粘附在丝绒布上，产生所有菌落的影印拷贝，然后将原始板移去，它可再用来培养生成菌落(通常这个培养板可作为主平板将菌落储藏起来)。将一新的平板置于丝绒布上，这样就可以产生一个与主平板菌落一致的复制板。一个丝绒布可印制几个新平板。影印培养法可用来筛选菌落，亦可用来产生在不同强度下培养的平板。

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为了确定携带在质粒上的基因在酵母基因组中的位置，可将单个酶切片段(有时是随机缺失或插入片段)克隆到新的质粒上，并进行单个测定，以决定究竟哪一个片段可弥补突变株的遗传缺陷。一旦这一基因被精确定位，它的DNA序列也就知道了。这种由基因的表型到对应基因的序列的快速转变的特性是酵母菌作为实验生物的一大优点，没有任何其他真核生物能如此简单地进行基因克隆。

2 以酵母为材粹帜相辜核生物功能的研究

2.2.1 酵母的同源重组

酵母作为实验材料最引人注目的特点在于可将突变导向到基因组的特定位点上。基因导向(即将基因定向导入细胞内染色体的特定位置)在哺乳动物细胞里是极其困难的，因为转进的基因与染色体上的对应基因发生同源重组是罕见的。然而在酵母中，由于基因组较小，重组机制也不同，因而同源重组是经常发生的事件。所以对酵母遗传学家而言，基因导向是一个简单的操作过程。基因导向之所以对遗传分析是一个有力的工具，是因为通过诱变在试管

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中产生的基因变异可以准确地重新放置入酵母基因组中，一旦它与基因组整合，这种修饰过的序列可稳定地传递给子代细胞，其忠实性与任何自然基因相同。更为重要的是基因导向可对修饰过基因的功能进行最严格的测定，因为可用修饰过的基因直接取代自然基因。

酵母中的基因导向一般是用线状DNA分子而不是环状分子，因为DNA末端是重组酶的良好底物。这样，将一特定酵母内的质粒序列线性化后定向整合到完整基因组的那个基因中。用性酶将质粒线性化后定向整合。由于自由末端是重组所喜好的底物，所以质粒能容易整合到与质粒两端同源的染色体序列中。因此，携带标记基因(ura3)的质粒和感兴趣的基因(yfg)通过在质粒A处或B处切开可分别定向整合入相应基因中。若将在B处切开的质粒整合入含有Ura突变(标有*号)的酵母菌株中，转化子可用缺乏尿嘧啶的培养基筛选，注意图中目的基因经过复制，质粒能全部整合入酵母染色体中。通常情况下，遗传信息在目标位点不会丢失。这种简单的整合导致目的基因和质粒的插入序列的复制。包括标记基因的质粒序列可用来追踪遗传杂交中的整合位点。这种方法有时用于克隆基因的遗传作图。

用一修饰过的基因精确地替代自然基因称作基因置换(transplacement)，它涉及一个稍微复杂一点的过程，包含两个紧密联系的同源重组事件。非常明显，用失活的或修饰过的基因取代染色体中的基因与简单的整合相比要复杂得多，因为前者要经过两次重组。为了使染色体yfg基因失活，需把质粒上携带的yfg基因的一个性片段除去，并用标记基因

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ura3取代。这种插入毁坏了yfg基因的编码序列，通常会使此基因的功能完全破坏。从这种新质粒上分离毁坏了的yfg序列，将此片段 (而非整个质粒)转化迸含有Ura3突变的酵母菌株中。欲转化的片段分别在染色体yfg基因的两端通过两次重组，即可用经过基因工程改造过的基因取代染色体上的基因。虽然转化效率较低，但却是切实可行的。整合子可通过在缺乏尿嘧啶的培养基上生长来筛选，整合片段的结构可通过酵母DNA的southern印迹分析来确定。注意这种方法与前面讨论的简单整合的不同点:染色体序列是被取代而不是简单地被复制。当在二倍体菌株中进行这种操作时，只是对yfg两个等位基因中的一个进行了剔除。为了检测剔除一个野生型等位基因的效果，需使二倍体细胞出芽产生单倍体孢子来进行。

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在最极端的基因置换中，可用一完全失活的基因取代自然基因。通过这种称作基因剔除 (gene knockout)的基因替代操作，研究人员通过观察基因剔除后酵母能否正常生长来确定这一基因的功能。如果某一基因对酵母生长是必需的，基因剔除对单倍体细胞的生长有致命的影响。因此，通常对二倍体酵母实施基因剔除。如果一个基因被破坏，由于野生型基因拷贝的存在，酵母仍然能够存活。对所产生的二倍体实施诱导，使其进入减数形成4个子代孢子。如果剔除的基因是致命的，那么将有一半孢子死亡，如图9-8所示。通过氮素饥饿诱导二倍体细胞形成孢子并进行减数，所形成的 4个单倍体袍子被紧密地包裹在一种称作子囊的结构里。用酶消化子囊壁，并将孢子簇(四分体)置于平板上，利用显微操作器(micromanipulator)将四分体分割成4个单个孢子，使每一孢子出芽并形成菌落。在4种孢子中，两种携带野生型等位基因(yfg)，另两种携带被ura3基因整合后(yfg::ura3)破坏了的yfg等位基因。如果被剔除的基因对细胞的生长是必需的，每个子囊的4个孢子中只有两个(携带yfg等位基因)能长成菌落，且它们不能在缺乏尿嘧啶的培养基上生长(因为ura3基因仅存在于被剔除的等位基因上)。

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2.2.2 酵母基因与高等生物基因具有相似的信号途径

有性周期(即通过单倍体细胞接合形成二倍体)这种特性在酵母突变遗传分析中有一定的实用价值，但接合过程本身所形成的能育领域就很有研究价值，因为它涉及所有高等真核生物一般的过程。酵母细胞可以两种单倍体接合型存在，叫作a型和α型，a型和α型接合产生二倍体。接合过程伴随着外激素(由两种单倍体各自分泌的小分子多肽激素)的释放。单倍体细胞一旦接收到这种外激素信号，就会触发一系列准备细胞接合的事件发生，包括细胞形态改变、接合所需要的基因的活化、细胞生长停滞使得接合能够进行。外激素是如何引发这些事件的发生，引起了生物学家的极大兴趣，因为相似的信号控制着比酵母更加复杂的多细胞生物发育和功能发挥的多个方面。

利用简单的遗传选择已经确定出了这种信号途径中的组成成分。如果a细胞在含有α因子(由α细胞产生的外激素)的培养基上培养，这时a细胞停止生长，因为它们在等待接合，因此，在含有α因子的平板a细胞不会形成菌落。对选择出的a细胞突变株的研究表明，它在含有α因子的培养基中并不停止生长，因而能形成菌落。从这种突变中分离出了一系列基因，称作ste基因，因为突变体是不育的(不能发生接合)。通过与接合缺陷型的互补(可利用简单的影印平板方法来完成)克隆到了野生型ste基因，并对其进行了序列分析，对它们的功能也有了大概的了解。如ste2基因编码与哺乳动物细胞激素受体相类似的一种蛋白质，表明这种蛋白质可能是α因子的受体，后来的生化和遗传实验证实了这种推测。对其他ste基因编码的产物也进行了确定，包括参与a细胞外激素生产的酶类、蛋白激酶、在其他生物体内调节信号过程的关键性酶以及在其他系统中起开关作用的G蛋白亚基。

根据克隆ste基因所提供的序列信息，提出了外激素信号传导途径的初步观点。外激素通过高度特异性的细胞受体蛋白起作用，这些蛋白质分别由a细胞和α细胞的 ste2和ste3基因编码。受体又通过gpa1，ste4，ste18基因编码的由3个亚基组成的G蛋白复合体起作用。遗传分析表明，β和γ复合体蛋白促进这种信号传导，而GPA1蛋白抑制这一过程。ste5，ste7和ste11这3个基因编码的蛋白质在G蛋白复合体的下游发挥作用。目前尚不清楚，究竟是这3个蛋白质中的一个直接与G蛋白复合体相互作用还是应答于G蛋白复合体的激活而产生1个小分子(第二信使)来激活这3种蛋白质。ste7和ste11编码蛋白激酶，而 ste5基因的产品还不清楚。ste5，ste7和ste11编码的蛋白质作用于ste12编码的转录因子。转录因子对于外激素信号的应答反应为活性增加，其结果是这些基因激活，这是酵母细胞接合所需要的。酵母菌的这种信号传导途径与高等生物有很多相似之处。遗传和生化实验提供了关于这些基因的功能以及途径中作用的次序方面的更多信息。例如，对ste12蛋白的生化

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研究表明，它是一种DNA结合蛋白，具有转录因子的作用，在接收到外激素的信号后将基因打开。下面的试验与这一假说相一致:将ste12基因装载于高拷贝的2μm DNA质粒上进行高表达，能部分弥补信号传递途径中早期功能基因突变体(包括受体突变)的接合缺陷。

通过遗传分析也进一步明确了G蛋白复合体是如何控制信号传递途径的。G蛋白复合体通常含有3个亚基α、β和γ。已鉴定出了分别编码β和γ亚基的ste4和ste18基因，因为这两种基因的突变使细胞抗α因子，且产生不育。由此可知，这两种基因的产物一定是信号传递途径中的活化子。相反，编码α亚基的基因在最初的α因子抗性筛选中未被发现，这是因为α亚基抑制信号传递，因而突变体的出现使信号传递通路总是畅通的，即便在缺乏外激素的情况下，细胞的生长也处于停滞状态。正像预料的那样，阻断信号通路下游(使Ste4， Ste5，Ste7，Ste11，Ste12或Stp18突变)，致死突变型可恢复生长。用哺乳动物G蛋白基因探针通过非严格杂交克隆到了编码α亚基的基因。有一实验室利用遗传途径，筛选出了携带酵母基因能使对外激素超敏感的细胞突变回复的质粒，这种突变细胞在极少量外激素存在的情况下也可使生长停滞。酵母中有一种突变体对外激素超敏感(Sst)，这可能是一种在外激素存在时适应或恢复的缺陷。即使是在低浓度、对正常细胞无碍的外激素存在的情况下，这种细胞也能停止生长。为了克隆能纠正这种缺陷的基因，用建立在多拷贝2μm DNA质粒

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中的酵母基因文库转化Sst细胞，并选择在较低α因子外激素存在的情况下具有生长能力的细胞。分离出两种质粒，一种携带野生型sst2基因。这种基因片段也能纠正存在于低拷贝 CEN质粒的同种缺陷，这是因为它是通过简单的互补菌株中的扶主突变来发挥作用的。另一种基因只在高拷贝质粒中才能起作用，表明它是在信号传导途径的其他地方通过抑制突变体的表现来发挥作用。这种基因叫做sgg1，与gpa1基因完全一样，编码外激素信号传导途径中的G蛋白。现在已经知道，这种蛋白抑制外激素信号传导，这就是为什么它能回复对外激素超敏感突变体的原因。在多拷贝的2μm DNA质粒上过量表达α亚基(由gpa1基因编码)能够使这种超敏感细胞回复，因为α亚基的作用是抑制信号传递通路。有趣的是用低拷贝的CEN质粒表达这一基因却毫无效果。用互补方法容易克隆酵母基因，同时还能调节基因表达的高低，这两方面对将信号途径进行分解是非常有效的。

2.2.3 用酵母遗传实验解答某些生化难题

基因容易从酵母中导人和剔出，这使设计遗传实验来说明细胞中进行的生化反应成为可能。在外激素信号途径中，对ste2和ste3的序列分析表明它们分别编码α因子和a因子受体。生化方面的研究也与这个模型相一致，但证据来自对携带Ste2和Ste3突变的酵母进行的遗传实验。这些突变体对外激素无反应，但若导入野生型ste2基因，它们对α因子敏感，导入野生型ste3基因，它们则对a因子敏感。正常情况下单倍体a细胞只表达ste2基因 (ste2基因编码α因子受体)，不能表达编码a因子受体的ste3基因。假如ste基因发生突

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变 (Ste2)，a细胞对两种因子都不起反应。为了验证假定的受体基因是否确实对外激素起特异性反应，构建了分别携带ste2和ste3基因的两种质粒。这两种基因的表达都在GAL1启动子的控制之下，启动子可根据细胞中能量来源的供给方式开启或关闭。这个受体交换试验清楚地说明了两个事实:第一，这些基因确实编码受体蛋白；第二，两种受体都能准确地激活同一信号传递途径。

另一用遗传实验确证生化问题的例子来自对酵母RNA剪切的研究。生化数据表明，在剪切过程中内含子序列与U2核内小RNA间有严格的碱基配对作用。为了检验在细胞内是否确实存在所提出的相互作用，于是便设计了一个遗传实验。首先对酵母组氨酸生物合成基因his4进行了加工，使得它的表达需要剪切一个内含子。将这个修饰过的基因整合到his4缺陷型酵母基因组中，只要这种细胞能够将内含子剪切掉，它们就能在缺乏组氨酸的培养基上生长。其次，对该基因进一步加工，替换内含子序列上一个能被U2 RNA识别的核苷酸。由于这种突变体的RNA不能被剪切，因而携带这种基因的细胞不能在缺乏组氨酸的平板上生长。为了证明U2 RNA是否能够识别内含子序列，构建了一个U2基因的突变体。此突变体含有一个单个碱基替换，恰好能与在内含子序列上含有单个碱基替换的突变体形成严格的碱基配对作用。把U2基因突变体加入到携带内含子突变的菌株中在缺乏组氨酸的培养基中培养，结果内含子的剪切作用恢复，酵母也能在培养基上生长。对几种不同组合的内含子和U2突

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变体检验表明，只有正确的碱基配对才能保证his4基因的表达。因此，U2 RNA对内含子的识别一定是直接的。

以上两个例子表明了如何利用酵母遗传实验来研究细胞内大分子间的相互生化作用。实验中，人们设计出了一个更有广泛意义的方法，利用酵母遗传学直接研究蛋白质之间的相互作用，在此之前，这是生物化学家研究蛋白质的独有领域。这种方法如下图所示。人们观察到，酵母Gal4蛋白像许多其他转录因子一样，由两个的功能区组成，即DNA激活区和转录复活体激活区。因此，通过把两种感兴趣的蛋白质中的一个与Gal4 DNA结合区融合，另一个与激活区融合，可检验这两种蛋白质是否在细胞中发挥相互作用。如果这两种蛋白质在细胞内具有相互作用，那么Gal4就会装配成一个具有活性的类似于转录因子的结合蛋白，在它的激活作用下，Gal1启动子打开。若将lacZ报告基因置于Gal1启动子的控制下，通过直接测定β-半乳糖苷酶的活力或利用培养基中加有X-gal的方法可检测到起相互作用的另一种蛋白质。这种方法可用来寻找已知蛋白质的结合蛋白。将已知蛋白的编码序列与Gal4 DNA结合区的编码序列相融合，将基因文库或cDNA文库中的基因插入到编码Gal4激活区的

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编码序列中，通过观察lacZ基因的启动就可筛选到与已知蛋白起协同作用的蛋白。

2.2.4 用酵母遗传分析鉴别和研究高等生物基因

本章已经强调过通过对酵母复杂过程的研究如何对那些难以操作的细胞类似过程的功能加以了解，并列举了诸如转录、剪切和细胞信号等例子。现在已经提出了一些在酵母细胞中研究哺乳动物基因的更为直接的方法。有些哺乳动物的基因和酵母的基因非常相似，它们在彼此的细胞中都能发挥正常或近乎正常的功能。在这种情况下，就可用酵母细胞来直接研究哺乳动物基因。在酵母细胞中检测哺乳动物基因功能的简单工具是穿梭质粒，其过程总结于图 9-14。图中的试验是为了说明可用哺乳动物细胞依赖cAMP蛋白激酶替代酵母中由tpk1基因编码的同种酶类。酵母菌中有3种功能上等同的tpk基因－tpk1，tpk2，tpk3。构建了这样一种菌株，通过整合入ura3，trp1和his3这3个基因，将酵母染色体中的3个tpk基因剔除。酵母至少需要3个tpk基因中的一个才能生长，因此，接受了携带有tpk1基因的ADE8质粒的菌株能够存活(ade8基因使细胞在缺乏腺嘌呤的培养基上能够生长)。将一编码小鼠蛋白激酶的cDNA装载到Leu2质粒上转化上述菌株，在缺乏亮氨酸和腺嘌呤的培养基

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上筛选携带这两种质粒的菌落。下一步是将一种菌落中的细胞在含有亮氨酸和腺嘌呤的非选择性完全培养基(YPD)上培养，在这种生长条件下，细胞只能保持两个质粒中的一个。为了确定细胞将保留哪一个质粒，先将细胞培养在非选择性YPD培养基上，再将其影印培养在缺乏亮氨酸和腺嘌呤的培养基上。结果是有些细胞能在缺乏亮氨酸的培养基上生长，但所有细胞都不能在缺乏腺嘌呤的培养基上生长，表明编码小鼠蛋白激酶的cDNA(位于leu2质粒上)能够使细胞存活。这样就从生化角度确定了这些酵母细胞中只含小鼠蛋白激酶。

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利用酵母细胞研究人的ras基因特别有用。ras基因是一原癌基因，酵母中也会有这一基因，且在结构上和功能上与人类的这一基因非常相似。事实上，对人的ras基因加以适当修饰后就可替代酵母细胞中的同类基因。在哺乳动物细胞中，Ras蛋白与GAP蛋白(GTP酶激活蛋白)相互作用。酵母中也会有GAP相关基因，即ira1和ira2基因。人类GAP蛋白和GAP类似蛋白都与人的一种遗传病－神经纤维瘤相关，而这两种蛋白都可以取代酵母ira基因所产生的蛋白质。这方面的研究大大促进了对这些重要人类蛋白的了解。

利用酵母研究人类基因的最大用途在于通过酵母突变的遗传互补直接克隆新的人类基因。在研究细胞调节生长的过程中，一个重要的进展是分离到了一个人类基因，它可以弥补粟酒酵母中的一个细胞周期控制基因的突变。这仅仅是利用酵母这种简单的真菌来进行人类细胞基因功能研究的许多例子中的一个。

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