您的当前位置：首页多囊卵巢综合征大鼠模型LHR_INSR和AR基因甲基化的变化

多囊卵巢综合征大鼠模型LHR_INSR和AR基因甲基化的变化

来源：品趣旅游知识分享网

2010年　1月第30卷　第1期

文章编号:100126325(2010)0120063204

基础医学与临床

Basic&ClinicalMedicineJanuary2010Vol.30　No.1

研究论文　

多囊卵巢综合征大鼠模型LHR、INSR和AR基因甲基化的变化

朱　亮,邢福祺,全　松,张文颖,杜建新

(11第306医院妇产科,北京100101;21南方医院妇产科生殖医学中心,广东广州510515)

摘要:目的复制一种理想的多囊卵巢综合征(PCOS)动物模型,并检测

LHR、INSR和AR基因DNA甲基化状态。

方法给模型组24日龄大鼠皮下埋植左旋182甲基炔诺酮硅胶棒3mm/只,3d后每日2次皮下注射人绒毛膜促性腺激素1.5IU。给对照组皮下注射等体积生理盐水。注射9d后观察大鼠卵巢形态学(HE染色),放射免疫法测定性激素和空腹胰岛素水平,己糖激酶法测定空腹血糖水平,计算胰岛素抵抗(HOMA)指数。用甲基化特异性PCR检测LHR、INSR和AR基因的DNA甲基化状态。结果模型组大鼠卵巢重量和体积均显著高于对照组

(P<01001)。模型组卵巢各级发育期卵泡及黄体少见,卵泡多呈囊性扩张。模型组大鼠血清孕激素、睾酮、促黄体

生成激素(LH)、空腹胰岛素、空腹血糖水平均显著高于对照组(P<0105);LH/促卵泡生长激素(FSH)比值和

HOMA指数也均显著高于对照组(P<01001)。模型组INSR基因甲基化率为7617%,显著高于对照组(2010%)(P<01001)。结论DNA甲基化介导的胰岛素受体基因转录抑制是PCOS胰岛素抵抗发生机制之一。

关键词:多囊卵巢综合症;DNA甲基化;动物模型

中图分类号:R711175　　文献标志码:A

ChangesofLHR,INSRandARgenesπmethylationinratpolycysticovarian

syndromemodel

ZHULiang,XINGFu2qi,QUANSong,ZHANGWen2ying,DUJian2xin

Nan2FangHospital,Guangzhou510515,China)

(11DepartmentofGynecologyandObstetrics,the306HospitalofPLA,Beijing100101;21AssistedReproductiveCenter,

Abstract:Objective　ToestablishananimalmodelofPCOSandtodetecttheDNAmethylationstatesofLHR,IN2

SRandARgenes.Methods　242days2oldfemaleSprague2Dawley(SD)ratswererandomlydividedintotwo

groups.Theratsintheexperimentalgroupweregivensubcutaneousimplantingoflevonorgestrelsilicagelstaffandinjected115IUhCGtwicedailyfor9daysfromthe4thday.Theratsinthecontrolgroupwereinjectedwithnor2malsalineatthesametime.Ovarianmorphologicchanges,sexhormonelevels,fastingseruminsulinandglucoseweredetected.TheLHR,INSRandARgenesπDNAmethylationpatternswerecheckedbymethylationspecificPCRinmodelinggroupandcontrolgroup.Results　Theovarianweightandvolumeinmodelinggroupwerehigherthanthoseincontrolgroup.Theovariesinmodelinggroupshowedmultiplefollicularcysts,andthenumberofthecacellsandinterstitialcellsincreased.Lessdevelopedfolliclesandcorpusluteawereseem.Theserumlevelofpro2gesterone,testosterone,luteinizinghormone,fastinginsulinandglucoseweresignificantlyhigherinexperimentalgroupthanthoseincontrolgroup,soastheLH/FSHratioandHOMAindex.NomethylationofLHRandARgeneswerefoundinbothgroups.ThemethylationfrequencyofINSRgene(7617%)wassignificantlyhigherinmodeling

收稿日期:2008-06-10　　修回日期:2009-07-06

基础医学与临床　　Basic&ClinicalMedicine2010130(1)

groupthanthatincontrolgroup(P<01001).Conclusion　ThedepressionofINSRgeneπstranscriptionalinducedbyDNAmethylationisimportantinthedevelopmentofinsulinresistanceinPCOS.Keywords:PCOS;DNAmethylation;animalmodel

　　多囊卵巢综合征(polycysticovariansyndrome,PCOS)是育龄期妇女常见的生殖内分泌紊乱性疾病,

染色;余下卵巢组织待提DNA。血清E2、T、P、FSH、LH及空腹胰岛素(fastingbloodinsulin,FINS)的检

是引起无排卵性不孕的主要原因,其发病率占育龄期妇女5%～10%,占无排卵性不孕30%～60%。既往关于其病因学的研究主要集中在寻找特异基因上,但至今仍未找到公认的特异基因

[1]

测均采用放免法;空腹血糖(fastingbloodglucose,FBG)的检测采用己糖激酶法。115　DNA甲基化检测

。本研究拟从表观提取样品基因组DNA后按甲基化修饰试剂盒说明书操作进行基因组转化;设计甲基化特异性引物(表1);甲基化特异性PCR(methylationspecificPCR,MSP);2%琼脂糖凝胶电泳检测。

表1　甲基化特异性PCR引物序列

Table1　PrimersequencesformethylationspecificPCR

INSR2MFINSR2MRINSR2UFINSR2URLHR2MFLHR2MRLHR2UFLHR2URAR2MFAR2MRAR2UFAR2URM1methylation

5′2TAGCGGGTTTTAGTTGTGC23′5′2AACTCGACTCCGACCAATA23′5′2TTTTAGTGGGTTTTAGTTGTGT23′5′2AACTCAACTCCAACCAATAAAC23′5′2ACCTTAACTCACTAAACCCG23′5′2ATTTATTTTATTGTTTAGTAGATAC23′5′2ATTTATTTTATTGTTTAGTAGATAT23′5′2ACCTTAACTCACTAAACCCA23′5′2TTTCGTTGGTCGGTAGTTTAC23′5′2CAAACGACGACCTCTACAAC23′5′2TTTTTTTGTTGGTTGGTAGTTTAT23′5′2ATACAAACAACAACCTCTACAAC23′specificprimer;

U1unmethylation

specificprimer;

遗传学角度探讨PCOS的发生机制,检测促黄体生成激素受体(luteinizinghormonereceptor,LHR)、胰岛素受体(insulinreceptor,INSR)和雄激素受体(androgenreceptor,AR)基因的DNA甲基化状态。

1材料与方法

111　实验动物与分组21日龄SPF级雌性SD大鼠(南方医科大学实验

动物中心),体质量45～60g,合格证号SCXK(粤)200620015。60只大鼠随机均分入模型组和对照组。112　药物与试剂

左旋182甲基炔诺酮硅胶棒(上海达华制药厂);注射用hCG(广东丽珠医药集团股份有限公司);血清雌二醇(estrodiol,E2)、睾酮(testosterone,T)、孕激素(progesterone,P)、促卵泡生长激素(folliclestimulatinghormone,FSH)和促黄体生成激素(luteinizinghor2mone,LH)放免法试剂盒(天津德普公司);胰岛素(insulin,Ins)放免法试剂盒(北京原子高科股份有限

公司);DNA提取试剂盒(天津天根生物技术有限公司);甲基化修饰试剂盒(上海杰美基因医药有限公司);由上海英骏生物技术有限公司合成引物。113　造模方法

F1senseprimer;R1antisenseprimer

116　统计学分析

两组大鼠适应性喂养3d,24日龄造模组大鼠皮下埋植左旋182甲基炔诺酮硅胶棒3mm/只,27日龄始每日2次皮下注射hCG115IU,共9d;对照组大鼠注射等量生理盐水。114　标本获取及激素检测

计量资料数据用—x±s表示,按两样本t检验分析。计数资料按χ检验分析。

2　结果

211　一般情况

两组大鼠在注药的第9天晚8时开始禁食。次晨称重,抽取腹主动脉血2～3mL;称重并测量卵巢大小,卵巢大体镜下诊断参照Stener2Victorin等

[2]

模型组和对照组大鼠均发育良好,体毛润泽,行为、体征无明显差异,反应灵活。两组大鼠的体质量无显著差异,模型组大鼠的卵巢重量和体积均显著大于对照组(P<01001)(表2)。

的

标准;切取部分卵巢组织,常规石蜡包埋、切片,HE

2010130(1)基础医学与临床　　Basic&ClinicalMedicine213　血清性激素水平及胰岛素抵抗的评估

表2　模型组和对照组一般情况的比较

Table2　Generalconditiondifferencesbetween　　　　modelingandcontrolgroup

—

　　　　(x±s,n=30)

模型组大鼠血清P、T、LH水平均显著高于对照组(P<0105);模型组LH/FSH比值显著高于对照组(P<01001)(表3)。模型组大鼠血清FINS、FBG均显著高于对照组(P<0105,P<01001),HOMA指数也显著高于对照组(P<01001)(表3)。

表3　模型组和对照组性激素、空腹血糖和空腹

　　胰岛素水平的比较

Table3　Comparisonofthelevelsofsexhormones,　　　　FINS,FBGandHOMAinsulinresistance　　　　indexbetweenmodelingandcontrol

—

　　　　group(x±s,n=30)items

weight(g)

ovarianvolume(mL)ovarianweight(mg)

controlgroup6819±41101033±01004113±4197

modelinggroup7014±41901044±01013359113±81813

P<01001comparedwithcontrol

212　卵巢形态学改变

模型组大鼠的卵巢表面苍白,隐约可见包膜下扩张的卵泡;对照组大鼠的卵巢表面色泽较红。HE染色光镜下见模型组大鼠卵巢皮质内各级发育期卵泡及黄体少见;卵泡多呈囊性扩张,卵泡内卵母细胞或放射冠消失,颗粒细胞层数减少(多为2～3层),排列疏松;卵泡膜细胞、间质细胞增生。对照组大鼠卵巢镜下见发育各个时期的卵泡和黄体;颗粒细胞形态完整,排列整齐,多为8～9层;卵泡膜细胞、间质细胞未见增生(图1)。

items

E2(pmol/L)P(nmol/L)T(nmol/L)FSH(IU/L)LH(IU/L)LH/FSHFINS(μIU/mL)FBG(mmol/L)HOMAindex

controlgroup106±4512152±51290132±01072113±011173±01740187±014713108±31933185±01242127±0177

P<01001comparedwithcontrol

modelinggroup

115±4719179±910130139±011031187±01842119±012531135±0146315173±41484149±013833118±11083

3333

P<0105,

214　LHR、INSR和AR基因的甲基化检测

两组大鼠卵巢均未检出LHR和AR基因甲基化条带;均检出INSR基因甲基化条带(图2),模型组甲基化率显著高于对照组(7617%vs2010%,

P<01001)。

图1　模型组和对照组卵巢HE染色

Fig1　OvaryHEstainingofmodelandcontrol　　　group(×100)

A1control;B1modeling

图2　INSR基因MSP结果Fig2　MSPresultsofINSRgeneA1control;B1modeling;

M1methylation;U1unmethylation

基础医学与临床　　Basic&ClinicalMedicine2010130(1)

3　讨论

由于PCOS患者很少会接受外科学的治疗手段,建立一种理想的PCOS动物模型十分必要。本研究中采用的建模方法于19年由Bogovich首先提出

[3]

学角度探索AR、LHR和INS基因在PCOS发生中的作用。

既往研究证实,PCOS患者胰岛素依赖的受体磷酸化异常、胰岛素受体作用底物磷酸化异常和GLUT4缺陷导致的葡萄糖转运率低下是PCOS患者

,先用左旋182甲基炔诺酮硅胶棒抑制下丘

发生胰岛素抵抗的机制

[8-10]

。学者们普遍认为

脑2垂体2卵巢性腺轴的功能,使性激素分泌处于较低水平,抑制排卵,然后利用hCG发挥LH的作用导致卵巢多囊改变和一系列内分泌方面的改变。本研究结果显示,模型组大鼠不仅具有类似多囊卵巢的病理特征,还出现了雄激素水平升高、LH/FSH升高等PCOS典型的病理生理改变

[4-5]

PCOS胰岛素抵抗发生在受体后水平,胰岛素受体本

身的结构和功能并没有异常。本研究结果显示,PCOS动物模型表现为明显的胰岛素抵抗,经DNA

甲基化检测发现模型组大鼠INSR基因甲基化率显著高于对照组。INSR基因甲基化率增高会使INSR基因的转录受到抑制,从而影响胰岛素受体的功能。胰岛素受体的功能障碍则会导致胰岛素抵抗的发生。也就是说,模型组大鼠出现明显的胰岛素抵抗可能是由于INSR基因甲基化异常造成的胰岛素受体功能障碍所导致的。提示PCOS的胰岛素抵抗不仅仅发生在受体后水平,胰岛素受体本身存在功能异常。这对于PCOS胰岛素抵抗的发生机制是一种全新的补充,对于其他疾病(如糖尿病)胰岛素抵抗发生机制的研究也有重要的理论指导意义。

。此外,利用评

[6]

估胰岛素抵抗的经典指标HOMA指数

,发现模型

组大鼠胰岛素抵抗程度显著高于对照组。说明此动物模型可用于PCOS胰岛素抵抗的研究。PCOS有明显的家族聚集性[7]

,且易在一级亲属中发生,提示遗传因素为其病因学上的一个重要因素。但至今还未发现与PCOS确切相关的特异基因。表观遗传学是一种不通过改变DNA序列而能调节基因表达的分子现象参考文献:

[1]Luque2RamirezM,SanMillanJL,Escobar2MorrealeHF.

Genomicvariantsinpolycysticovarysyndrome[J].ClinChimActa,2006,366(1-2):14-26.

[2]Stener2VictorinE,PlojK,LarssonBM,etal.Ratswith

steroid2inducedpolycysticovariesdevelophypertensionandincreasedsympatheticnervoussystemactivity[J].ReprodBiolEndocrinol,2005,3(1):44-53.

[3]BogovichK.Inductionofovariancystsinprogesterone2syn2

chronizedimmaturerats:evidencethatsuppressionoffollic2ulararomataseactivityisnotaprerequisitefortheinductionofcysticfollicles[J].Endocrinology,19,124(4):16-1653.

[4]EhrmannD.Polycysticovarysyndrome[R].NEnglJ

Med,2005,352(12):1223-1236.

[5]ChhabraS,McCartneyCR,YooRY,etal.Progesterone

inhibitionofthehypothalamicgonadotropinreleasinghor2monepulsegenerator:evidencefrovariedeffectsinhy2perandrogenemicadolescentgirls[J].JClinEndocrinolMetab,2005,90(5):2810-2815.

[6]Diamanti2kandarakisE,KouliC,Alexandrakik,etal.

[2]

。本研究从表观遗传

Failureofmathematicalmodelstoaccuratelyassessinsulinresistanceinlean,overweightorobesewomenwithpolycys2ticovarysyndrome[J].JClinEndocrinolMetab,2004,(3):1273-1276.

[7]Kahsar2MillerMD,NixonC,BootsLR,etal.Prevalence

ofpolycysticovarysyndrome(PCOS)infirst2degreerela2tivesofpatientswithPCOS[J].FertilSteril,2001,75(1):53-58.

[8]MontagnaniM,GolovchenkoI,KimI,etal.

Inhibitonof

phosphatidylinositol32kinaseenhancesmitogenicactionsofinsulininendothelialcells[J].JBiolChem,2002,277(3):1794-1799.

[9]DeUgarteCM,BartolucciAA,AzzizR.Prevalenceofinsu2

linresistanceinthepolycysticovarysyndromeusingtheho2meostasismodelassessment[J].(6):14-1460.

[10]GalluzzoA,AmatoMC,GiordanoC.

vascDis,2008,18(7):511-518.

Insulinresistance

andpolycysticovarysyndrome[R].NutrMetabCardio2

FertilSteril,2005,83

因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容

查看全文